電子顯微鏡生物標本的制備及觀察實驗

家兔

透射電子顯微鏡 超薄切片機 解剖鏡 震蕩器 恒溫箱 干燥器 離子鍍膜機 單面刀片 銅網 解剖器材

乙醚 戊二醛 二甲砷酸鈉緩沖液 鋨酸 乙醇 丙酮 環氧樹脂包埋劑 醋酸鈾染液 檸檬酸鉛染液 單寧酸 乙酸異戊脂

一、取材

1.  取活兔用乙醚麻醉，迅速打開腹腔，暴露肝臟，用鋒利的刀片切取1 mm³ 肝組織，立即投入固定液中。

2.  取材要求迅速，通常將動物麻醉取材，如動物處死后取材，要在幾分鐘內完成。

3.  取材最好在低溫條件下進行（0~4℃），以防止動物死后細胞缺氧發生超微結構變化。

圖1  透射電鏡結構

二、固定

1.  把肝組織立即投入到0.1 mol/L（pH7.4）的二甲砷酸鈉緩沖液配制的2.5%戊二醛中，4℃固定二小時（也可用0.1 mol/L （pH7.4）的磷酸緩沖液配制的2.5%戊二醛）。

2.  然后用0.1 mol/L（pH7.4）的二甲砷酸鈉緩沖液洗三次，再放入用相同緩沖液配制的1%鋨酸中固定2小時（4℃）。

3.  固定的作用是用化學試劑使細胞的微細結構如同生前狀態精確地保存下來。

4.  固定劑應能迅速進入細胞，穩定細胞結構，使其不變形，在脫水過程中不丟失細胞成分。

三、脫水

1.  用雙蒸水清洗固定好的肝臟標本，按順序投入到30%、50%、70%的乙醇中，在4℃條件下各10分鐘。

2.  然后再投入到80%、90%、95%的丙酮中各10分鐘，100%的丙酮中兩次，每次10分鐘，一般可在室溫下進行（如實驗需中途停頓可把標本放在70%乙醇中過夜）。

3.  脫水的目的是用脫水劑，把組織細胞內的游離水去除干凈，使包埋劑能夠均勻地滲入細胞內。

四、浸透

1.  把標本由100%丙酮中移入裝有混勻包埋劑的小瓶中，在30℃下震蕩4小時（可用紅外線燈加溫促進浸透）使包埋劑置換出標本中的丙酮。

2.  電鏡生物標本常用環氧樹脂作包埋劑，聚合后可切成超薄切片，并耐電子束轟擊。

五、包埋

1.  把標本放入膠囊底部，將混勻的包埋劑分裝入膠囊中，加好標簽，勿使傾倒保持直立。

六、聚合

1.  把裝有標本和包埋劑的膠囊置35℃、45℃、60℃溫箱中各24小時，使包埋劑聚合，硬化。

2.  由流體變為均勻的固體。這樣在切片時，包埋在其內的肝組織才能保持結構不變。

七、超薄切片

1.  一般透射電鏡的切片厚度不能超過100 nm，厚于100 nm 的切片電子束不能穿透或影響觀察效果。

2.  通常超薄切片厚度為50~70 nm。

3.  在切片前，要對標本包埋塊頂端修成近45℃角的四邊錐體，使要進行切片的標本露出外表面，呈長寬約為0.4x0.6 mm 的長方形或梯形切面。

4.  然后再把標本塊夾在標本夾中，并把它固定在切片機臂的遠端。

5.  切片刀是用玻璃制成（也可用鉆石刀），甩膠布圍成水槽，裝滿水，切下的切片漂在水面，用銅網收集。

6.  切片的厚度可以從切片與水面反射光所產生的干涉色來判斷。

八、染色

1.  在平皿中放一臘紙片，滴一滴醋酸鈾染液于臘紙上。

2.  用彎頭小鑷子夾住銅網邊緣，把貼有切片的一面朝下，輕輕插入染液中，蓋上平皿蓋，室溫下染色10~20分鐘。

3.  水洗后同上法再置入檸檬酸鉛染液中染色15分鐘，1%NaOH溶液洗一次，水洗二次，干燥后觀察。

4.  染色的原理是利用重金屬（如鉛、鈾等）與組織中某些成分結合，可提高這些組分對電子的散射能力，增進超薄切片中不同組織成分對電子散射的差異，使細胞的超微結構得到充分表現，形成與細胞結構相應的圖像，并提高圖像反差，也稱電子染色。

九、觀察家兔肝細胞的超微結構

1.  肝細胞的結構：

（1）肝細胞為多角形，一側靠近血竇。

（2）核圓形1~2個，位于細胞中央，核仁1~2個。

（3）細胞質中有各種細胞器，粗面內質網的膜平行排列，聚集在一起。

（4）滑面內質網為分支彎曲的囊管組成，互相吻合成網，排列密集。

（5）高爾基復合體排列在核的周圍。

（6）還可見到溶酶體、過氧化物體、糖原、脂滴、分泌顆粒等。