電轉化法感受態大腸桿菌TGl的制備

[器材和試劑]

●大腸桿菌TGl菌株(Stratagen)

●37℃孵育箱(NewBrunswickScientmc)

●Sorvatl RC5離心機(或同類型)，GS3轉頭(均在4℃預冷)

●預冷的500m1聚丙烯離心管

●2L有擋板錐形瓶

●基本培養瓊脂板[10 5g K2HP04、4．5gKH2P04、1g(NH4)2S04、 0．5g Na3C6H5O72H2O、 15g瓊脂加水至幾。高壓滅菌，冷卻至錐形瓶微溫；接著加入lml lmol/L MgS04、0．5ml 1%維生素B：(硫胺)和10m120%右旋糖。

●2×Y培養基(將16g細菌培養用胰蛋白胨、10g酵母、5g NaCl加入到去離子水中并高壓滅菌)。

●lmol/L Hepes，(N-[2-羥乙基]哌嗪-N’-[2-乙烷磺酸])，pH 7．4

●lmol/L Hepes，pH 7．4，10%甘油

●10%甘油
易生物儀器庫：http://www.ebioe.com/yp/product-list-42.html
易生物試劑庫：http://www.ebioe.com/yp/product-list-43.html

[方法]

1．將大腸桿菌TG1種到基本培養瓊脂板，37℃過夜。

2．將基本培養瓊脂板上的大腸桿菌TGl再接種到含有15m1 2XTY培養基的100ml形瓶中。37℃振蕩培養過夜。

3．用5ml夜培養的TGl接種到兩個含500m1 2×Y培養基的2L有擋板錐形瓶中。在搖床中培養約1．5小時，直到A600接近0．5。

4．將菌液轉移4個預冷離心瓶中(約250ml/瓶)。平衡后，置于冰上20分鐘。

5．以3000g，4℃離心15分鐘。使用前預冷所有轉頭。

6，棄去上清，并以起始體積的冰冷lmmol/L Hepes溶液(約250m1)重懸每個錐形瓶中的細胞。所有溶液都應當新鮮配置。

7．再次以3000g，4℃離心15分鐘。

8．以一半起始體積的冰冷lmmol/L Hepes溶液(約125ml)重懸每個錐形瓶中的細胞；此時可合并到兩個離心瓶中。

9．再次以3000g，4℃離心15分鐘。

10．以總體積為20m1的10%甘油和lmm01/L Hepes混合液重懸所有細胞。

11．再次以3000g，4℃離心15分鐘。

12．如果細胞不是新鮮使用而是儲存，則需準備乙醇/干冰浴。

13．以總體積為2m1的10%甘油重懸細胞。

14．使用新鮮制備的細胞，或者用干冰浴等量分裝凍存細胞②。在檢測效率后，及時使用細胞(在1周內)。

用于電轉化的DNA不得含有鹽分。細菌/DNA混合物中如有鹽分可導致電弧(一種短路)的形成，應加以避免。總體上，在70℃10分鐘的熱滅活步驟后，可使用2/Il標準連接液進行連接。為構建抗體文庫，所用DNA必須使用酚/氯仿抽提以及乙醇沉淀法或選擇合適的試劑盒(例如Geneclean 或Qiagen)進行純化。