病毒的大規模純化技術

實驗概要

現代病毒研究往往需要大量的純病毒粒子，以便于化學研究或制備抗體。本文簡明地描述了一下脊髓灰質炎病毒（Polio virus）的純化步驟。它是一種已被廣泛研究的危害人體健康的病毒。

實驗步驟

1. 在大型裝置中培養病毒。為獲得足夠的用于化學研究的病毒，必須制備大量病毒。每種病毒的培養都有不同的步驟。脊髓灰質炎病毒是在人或靈長類動物細胞系中培養的，可以培養在一大瓶中沿壁生長的單層細胞上，也可以在一個輕輕攪拌的細胞懸液中。在有利病毒生長的條件下，每個宿主細胞能生產10～1000的感染單位的病毒，即每毫升一個感染單位的滴度（或稱效價）。

2. 富含病毒培養液的去除。病毒的生長和釋放伴隨著細胞的破損。在病毒復制完成的時候，培養液中大多數細胞已經變成了細胞碎片。為使所有病毒分子完全釋放，要通過反復冷凍—融化的循環過程使細胞進一步破碎。然后將富含病毒的液體從培養瓶轉移到離心試管中。低速離心除去大分子的細胞殘骸。

3. 通過沉淀將病毒物質濃縮。由于病毒是蛋白質性質的，它們能通過蛋白質沉淀法沉淀。脊髓灰質炎病毒可通過高濃度的NH₄Cl（每毫升培養液中加0.4g）沉淀下來。這一過程要在低溫下進行，NH₄Cl要在攪拌下緩慢加到培養液中。由于病毒蛋白沉降，溶液將變得渾濁。將沉淀物通過低速離心（2000g，1-2hr）。然后將含有病毒分子的沉淀物在少量磷酸鹽緩沖液中再次懸浮培養。這一步驟可濃縮病毒大約10倍，99％以上的病毒粒子可沉淀回收。

4. 通過密度梯度離心最終純化病毒。脊髓灰質炎病毒可以通過蔗糖或CSCl的密度梯度離心純化。在后者中，病毒在離心試管中成為一個分離帶，這一過程與對DNA的分離相同，離心須要高速，即120000g，且要進行好幾個小時，最好是一整夜。離心管中的液體通過試管底部的一點點滴出來，要檢測每一滴的病毒滴度。在合適的離心條件下，所有的病毒分子都集聚在一或兩個組分中，所以它們是非常純的。結晶脊髓灰質炎病毒。如果能在合適的條件下濃縮大量且高純度的病毒，就可以獲得病毒晶體。這種晶體為化學分析提供了很好的材料，且易于通過X射線衍射技術進行結構分析。