病毒DNA的提取實驗——培養細胞中病毒DNA的提取

細胞

裂解液TE 緩沖液

培養瓶EP管真空泵

1. 貼壁培養細胞傾去培養液，加 PBS 洗 2次,加胰蛋白酶消化 (37℃, 5~10 min)后移入Ep管中，2000 r/min 離心 10 min, 棄上清液，用 PBS 懸浮細胞，離心洗滌 2~3次，用 PBS 重新懸浮細胞， 3500 r/min, 棄上清液。

2. 懸浮細胞的培養 移入 Ep 管中，以 2000 r/min 離心 10 min, 棄上清液，用 PBS 懸浮細胞，余下的操作同貼壁培養細胞。

3. 加人 1/2 體積 2M NaCl 和 1/2 體積 20% PEG 6000( 聚乙二醇 6000), 充分混勻溶解，置于 4℃ 8~12 h 或過夜， 3500 r/min 離心 20 min, 棄上清液。

4. 加 1/10 原培養液體積的裂解液，混勻， 37℃作用 2~3 h 。

5. 用等體積的平衡酚抽提 1次，再用氯仿／異戊醇 (24:1)抽提 3~4次。

6. 加入 1/10 體積 2.5mmol/L NaAc pH 和 2倍體積無水乙醇，置- 20℃過夜。 15000 r/min 離心 10 min, 棄上清液，用 70% 乙醇洗 1次，倒置離心管自然干燥或真空抽干。

7. 加適量 TE 緩沖液溶解沉淀，做 DNA 模板。獲得病毒DNA。

1. 裂解液由 0.5%SDS 、10mmol/L Tris-HCl(pH 7.8)、5 mmol/L EDTA 、10 μg/ml RNase和 50μg/ml 蛋白酶 K 組成。

2. TE 緩沖液由 10 mmol/L Tris-HCl(pH 7.8) 和 10 mmol/L EDTA 組成。