石蠟切片和半薄切片的制作

實驗概要

本方法介紹了石蠟切片和半薄切片的制作流程。

主要試劑

4%戊二醛固定液(pH7.0磷酸緩沖液)，乙醇，二甲苯，純石蠟，蜂蠟，樹脂膠

主要設備

真空泵，AO手搖式切片機，Olypmus BH-2型顯微鏡，LKB超薄切片機

實驗步驟

1. 石蠟切片的制作

   1) 取材固定

新鮮配置4%戊二醛固定液(pH7.0磷酸緩沖液)，選取材料，立即投入固定液中用真空泵抽氣，以加快固定液滲透，更換一次固定液，放置過夜。

   2) 脫水、透明、浸蠟、包理

      a. 固定好的材料經70%、80%、90%、95%、100%、100%無水乙醇分別脫水1h；

      b. 用二甲苯置換材料中的乙醇，具體方法是：100%無水乙醇、50%乙醇-50%二甲苯、100%二甲苯、100%二甲苯，每級各1h；

      c. 浸蠟、包埋的具體方法如下：50%二甲苯-50%石蠟過夜，純石蠟24h，純石蠟24h，純石蠟 10%蜂蠟12h，包埋成石蠟塊；

      d. 用AO手搖式切片機進行切片，厚度為7-8um；

      e. 42℃展片，烘干。

   3) Toludine Blue O(TB O)染色

將帶材料的載玻片按以下步驟進行脫蠟、染色、封片。

二甲苯20min，二甲苯20min，50%二甲苯-50%無水乙醇5min，無水乙醇5min，無水乙醇5min， 100%、100%、95%、90%、80%、70%、50%、30%、10%梯度乙醇復水，每級2min，蒸餾水5min，1%TBO染色10s，自來水沖洗20min，蒸餾水5min，經10%、30%、50%、60%、70%、80%、 90%、95%、100%、100%梯度乙醇脫水，100%無水乙醇5min，100%無水乙醇5min，二甲苯5min，樹脂膠封片。

制得的石蠟切片用Olypmus BH-2型顯微鏡觀察與照相。

2. 半薄切片的制作

   1) 取材

將新鮮的植物葉片切成0.5cmX0.5cm的小片，避開主葉脈部分，立即投入到新配置的3.5%戊二醛固定液中，用真空泵抽氣，以加快固定液滲透，放置過夜。用0.1M pH 7.2的磷酸緩沖液沖洗2h，更換6次，再用1%的餓酸固定4h；

   2) 脫水、包理

用濃度梯度為45%、55%、70%、85%、95%、100% I、100% II的乙醇脫水，環氧丙烷過度2次，Epon812樹脂浸透、包埋、聚合；

   3) 切片、展片

用LKB超薄切片機將包埋好的材料切成厚度為1.5-2.0um的薄片，置于一滴水中將薄片展開，之后吸干多余水分，烘干；

   4) 染色、觀察

將烘干的薄片用亞甲基藍染色，顯微鏡觀察拍照。