神經細胞分散培養

一、設備
無菌操作設備。
二、大型設備
CO2培養箱
恒溫5%、10%CO2維持培養液中pH值
倒置顯微鏡：用于每天觀察貼壁細胞生長情況
解剖顯微鏡，用于準確地取材
常溫冰箱：-4℃，用于保存各種培養液，解剖液和鼠尾膠
低溫冰箱：-20℃--80℃，用于儲存血清酶，貴重物品和試劑
電熱干烤箱：用于消毒玻璃器皿
高壓消毒鍋：用于消毒培養皿，手術器械
過濾器：配制解剖液、培養液，必須過濾后才可使用，以去除細菌
滲透壓儀，pH劑，天平等
三、培養器皿及手術器械
1、培養皿：常用35mm塑料及玻璃皿，解剖取材用15mm-90mm直徑。
2、培養板，24-40孔，可用于開放培養。
3、培養瓶：
4、吸管，常用1，5，10ml，均需泡酸、洗滌、滅菌后方可使用。
5、各類培養液貯存器。
6、小型手術器械。
準備：
一、配制培養液
（1）解剖液：以無機鹽（去除Ca2+ , Mg2+）加葡萄糖配制成PBS緩沖液，保持一定的滲透壓和pH值。
（2）基礎培養基（MEM）：主要為多種氨基酸，加入葡萄糖，雙蒸餾水溶解。
（3）接種培養液：用于胰酶消化后的細胞分散，做成細胞懸液，其成分為MEM含1%谷氨酰胺，另加入10%馬血清，當天配制。
（4）維持培養液：接種后24h，全部換成此液，后每2周換一次，每次換1/2。其成分為MEM中含5%馬血清，1%谷氨酰胺，及適量的支持性營養物質。
二、培養基質 常用鼠尾膠、小牛皮膠，多聚賴氨酸，再涂膠
三、消毒培養皿的備用。所有培養器皿均需清水沖洗2-3d，達兩次ddH2O，每遍洗刷3-4次，加塞包裝，置于烤箱中干燥消毒，于培養前1天進行。
神經細胞分散培養
（一）選材 常用胚胎動物或新生鼠神經組織。雞胚常用胚齡6-8d，新生鼠或胎鼠（12-14d）或人胚胎。不過也有認為與組織相關。如大白鼠胚胎以19d為宜，小鼠以18d為宜，大鼠紋狀體以10d為宜；若紋狀體與黑質聯合培養的大鼠胚，則黑質以13d，紋狀體18-21d為宜；小腦以20-21d小鼠胚胎，所獲蒲氏細胞成活率高，顆粒細胞正在分化；脊髓與DRG聯合培養，常用4-7d雞胚或12-14d小鼠胚胎，取材易，神經成活率高。
（二）取材。腦則取出相應組織，在解剖液中先剪碎，以使胰酶消化。脊髓則固定于瓊脂板上，用小刀將其要成背腹兩側，分別培養。

（三）細胞分離與接種。神經組織用0.125-0.25%胰蛋白酶在37℃孵育30min，移入接種液，停止消化，并洗去胰蛋白酶液，用細口吸管吹打細胞懸液，使其充分分散，如此多次，待沉淀后吸出上層細胞懸液，計數，預置細胞密度，接種于培養皿（1×106），做電生理應為5×105或更低。
（四）抑制膠質細胞生長。培養3-5d后，也有人認為培養7d后，用阿糖胞苷，或5-FU抑制神經膠質細胞的生長。
（五）觀察。接種6-12h，開始貼壁，并有集合現象，細胞生長突起明顯，5-7d膠質細胞增生明顯，7-10d膠質細胞成片于神經細胞下面，形成地毯，2周時神經細胞生長最豐滿，四周暈光明顯，一個月后，有些神經細胞開始退化，變形，甚至出現空泡，一般培養2-4周最宜。

但神經細胞只能增大，而不能增殖，只能原代，不能傳代，不會有細胞周期，而且隨培養時間的延長，細胞數量在下降，但膠質細胞可以，神經膠質細胞也可以。在培養過程中，早期9-12d時，有較多的神經細胞死亡，這是第一次死亡階段，應注意保持條件的恒定。在此之后存活下去的細胞一般突起長而多，且相互形成突觸。