離體線粒體的氧化作用和磷酸化作用實驗

測氧儀                                                                  紫外分析儀                                                                  冷凍高速離心機                                                                  血色素吸管                                                                  玻璃管                                                                  層析用玻璃缸                                                                  移液管                                                                  反應瓶                                                                  研缽                                                                  DEAE                                                          

EDTA

2．反應液：

（1）0.1M磷酸緩沖液pH7.0

（2）1.5M蔗糖溶液（25.67g蔗糖用蒸餾水定容為50 ml ）。

（3）ADP（腺二磷）50mg/ ml （50mgADP溶于1 ml 水中）。

（4）CytC（細胞色素C）1mg/ ml （1mgCytC溶于1 ml 水中）。

（5）NAD（氧化輔酶Ⅰ）3.3mg/ ml （3.3mgNAD溶于0.5 ml 水，用NaOH調至pH7.0，再定容為1 ml ）。

（6）CoA（輔酶A）（每支50單位，250單位相當于1mg）。

（7）TPP（焦磷酸硫胺素）50mg/ ml （3.3mgNAD溶于0.5 ml 水，用NaOH調至pH7.0，再定容為1 ml ）。

（8）0.2MMgCl2(2.03gMgCl2·6H2O定容于為50 ml )。

（9）1.1M葡萄糖（10.9葡萄糖加水定容為50 ml ）。

（10）0.1M琥珀酸（0.118g琥珀酸溶于5 ml 水，用NaOH調至pH7.0，再定容為10 ml ）。

3．0.1M丙二酸（pH7.0）

0.017g丙二酸溶于1 ml 水中，用NaOH調至pH7.0，再定容為2 ml 。

4．0.025 N HCl

二、實驗步驟

1．線粒體懸浮液的制備

（1）25℃下暗處萌發3－4天的綠豆芽，摘取子葉，去掉下胚軸、根和芽。

（2）取30g子葉、40 ml 提取液和少量石英砂，在研缽中（研缽置于冰鹽浴中）快速研磨成勻漿，雙層紗布過濾。

（3）濾液于0℃下，3000rpm離心10分鐘，棄去沉淀。

（4）上清液于0℃下，12000rpm離心20分鐘，棄去上清液。沉淀懸浮于18 ml 提取液中。

（5）上述懸浮液在0℃，12000rpm下離心20分鐘，棄去上清液，沉淀懸浮于2 ml 提取液中，即為線粒體懸浮液。保存在冰箱中。

2．儀器安裝及耗O2量的測定

反應瓶主室中按下表加入反應液：

如圖，安裝好測氧儀、氧電極、記錄儀。檢查儀器是否正常。在側臂中加入0.5 ml 線粒體懸浮液，插入氧電極，密閉反應瓶，待測氧儀穩定后，將側臂內線粒體懸浮液輕輕倒入反應室，在磁力攪拌器上攪拌或不斷地輕輕搖動反應瓶。20℃下反應10分鐘。記錄氧分壓的變化，由記錄曲線比較正常的線粒體和加抑制劑的線粒體耗O2的變化。

測氧裝置圖

（4）風干后的薄層板在紫外分析燈下觀察形成的ATP。

實驗記錄及報告