科學家們怎樣看待利用CRISPR基因編輯改善CART療法

　　2017年8月和10月相繼在美國上市的Kymriah和Yescarta是CAR-T細胞治療領域頗具代表性的兩款產品。但它們在使用過程中均存在一定局限：必須采用病毒載體作為基因編輯系統的傳導中介，對人源性的T細胞進行改造。

　　近日，來自帕克癌癥免疫療法研究所的科學家聲稱他們采用CRISPR基因編輯技術，完善的一種新方法將改變CAR-T療法現有技術——為CAR-T細胞的構建和工業化生產都開啟了新的大門，且比第一代CAR-T療法的開發更容易。

　　此前已經有媒體報道，帕克癌癥免疫療法研究所的陣營非常豪華，科學家們大多來自于美國加州大學舊金山分校（UCSF）或是洛杉磯分校（UCLA），且均具有腫瘤免疫的研究背景。這篇于7月11日發表在的《Nature》雜志上的研究團隊同樣都是來自于UCSF或UCLA。

　　基于新一代基因編輯技術CRISPR輔助CAR-T療法的開發，大咖們是如何看待的呢？Endpoints主編John Carroll也采訪了多位與該技術開發相關的一線研究人員，以下是對他們的觀點綜合。

　　基因編輯技術CRISPR并不是什么新鮮事。理解起來也比較容易，就是一種基因編輯技術，能比較精準對生物的DNA序列進行修剪、切斷、替換或添加，在一些學術實驗室和相當多的商業實驗室風靡一時。

Antoni Ribas

　　加州大學洛杉磯分校研究員Antoni Ribas在業內頗具名氣，并參與了該項目。他表示團隊闡明的這項技術，或將替代病毒載體，后者常常供應短缺。

　　據了解，在此前的CAR-T細胞制備過程中，病毒載體的包被和測試需要較長時間，并且其導入過程是非定向的，遇到編輯過長的基因片段時甚至會殺死T細胞，同時在病毒寶貝過程中需要耗費大量的人工成本。

　　新方法意味著，將使得對T細胞的編輯更快（faster）、更好（better）、更便宜（cheaper）。

Fred Ramsdell

　　帕克癌癥免疫療法研究所的另一位科學家Fred Ramsdell對此點評道，“在過去，制備出合適的CAR-T細胞可能需要幾個月甚至一年的時間，而現在則僅需要數周的時間。對于癌癥患者而言，幾周與幾個月的時間，很有可能會使腫瘤細胞發展產生巨大的差異。”

　　同樣，對于開發CAR-T細胞療法的企業而言，更快的速度意味著更高的效率，提前占領市場的可能性也更大。

Alex Marson

　　UCSF微生物學和免疫學副教授Alex Marson補充道，CRISPR通過切割和中斷有效地敲除了基因。“你可以一次更換幾個核苷酸，”他指出，“但是如果你輸入更大的數據，就會殺死細胞。”

　　通過查閱科研文獻發現，新的方法運用了基因同源修復技術取代了原有的簡單粗暴的基因敲除模式，從而實現了插入基因的無縫對接，在最大化降低對原有基因損傷的同時還起到了精確定位的作用（如圖1）。

圖1：TCR技術中的同源修復策略，實現了插入位點和插入片段的精準化（上方是改造前的基因序列，下方是改造后的基因片段）

　　同時團隊利用具有Cas9蛋白表達的RNA復合物（RNP）和具有同源片段的雙鏈DNA模板取代了原有DNA環形質粒，這無疑降低了原有的高濃度DNA質粒對T細胞造成的毒性損傷。更為重要的是，新技術采用了電穿孔轉染的技術代替了原有的病毒導入，既簡化了工藝流程又降低的生產成本（圖2）。

圖2：新技術的工藝流程

　　“這對于改變T細胞的工作方式來說是一種靈活的方式，”Marson補充道，“團隊已經在實驗室中進行體外研究罕見和嚴重的小兒自身免疫疾病，還有一個項目是開發治療黑色素瘤的CAR-T療法，目前該方法已經成功地在小鼠中進行測試。”

　　現在焦點將轉移到人體試驗中。Marson坦言，他們團隊正就這項技術的轉化應用，與潛在的商業合作伙伴及FDA進行了交流，以探索該技術在臨床上的應用步驟。

Theo Roth

　　據加州大學舊金山分校的在校生、也是這篇文章的的主要作者Theo Roth透露，將新基因導入T細胞這一過程，人類已經嘗試了30多年。幸運的是，現在實驗室不再需要6到7個人使用病毒來設計T細胞。當下，全球已經有數百個實驗室在設計這些細胞，并且將工作越來越多地聚焦在復雜的DNA序列，并努力去嘗試更多的可能性，這顯然將加速未來幾代細胞療法的發展。