突破:4Pi超分辨顯微成像技術的“禁地”破除

　　由于具有無損、高特異性等特點，光學熒光顯微鏡一直是生物實驗室進行研究的必備之選。相較于二維成像，三維超分辨顯微成像技術在生物研究中具有顯著的優勢。由于光學衍射效應（Diffraction Effect），經典的單鏡頭顯微鏡系統在軸向（厚度方向）的分辨率表現不佳——即使是新興的超分辨顯微成像技術也概莫能外。為了追求三維一致的分辨能力，研究人員開發了基于對置雙鏡頭的4Pi顯微鏡架構，并進而開發了對應的超分辨版本。然而，由于鬼影效應（Ghost Image）和樣品像差累積效應，厚樣品成像一直是4Pi超分辨顯微成像技術的“禁地”。

　　2021年5月31日，由多家研究機構組成的聯合課題組在Nature Methods上發表文章Three-dimensional adaptive optical nanoscopy for thick specimen imaging at sub-50-nm resolution，提出了一種全新的、可用于4Pi顯微鏡架構的自適應光學（Adaptive Optics）策略，成功將4Pi超分辨顯微鏡的應用范圍擴展到了全細胞、組織等較厚的生物樣品。通過與isoSTED顯微成像技術相結合，作者們首次在實驗中從整個30-35 μm厚生物樣品內穩定獲取了三維亞50 nm分辨率，并藉此對一系列亞細胞結構進行了精細的三維成像。

　　為了實現上述目標，相對于原有4Pi超分辨顯微鏡特別是isoSTED，作者們做出了一系列開創性的系統升級（如圖1）。首先，他們改變了激光器布局，簡化了光路結構，增強了成像過程中的系統穩定性；進而使用空間光調制器（Spatial Light Modulator）進行光束整形以克服鬼影效應，打破了厚樣品成像的理論束縛（否則，為避免鬼影影響，isoSTED顯微鏡的成像深度僅可以達到數百納米）。其次，他們通過對光束的偏振調控，極大地降低了系統噪聲水平。最后，基于早先推導的4Pi像差模型，他們耦合使用了兩臺變形鏡（Deformable Mirror），建立了步進式的自適應光學像差補償策略，以保證系統分辨率的穩定。針對標準樣品（如：熒光顆粒樣品或神經組織切片樣品）的成像結果表明，無論是在表層還是深入樣品內部，由作者們開發的4Pi超分辨顯微鏡均可以獲得35-50 nm的三維、各向同性分辨率。

　　圖 1 本文作者所開發的自適應光學isoSTED顯微鏡主光路設計渲染圖。

　　在隨后的實驗中，作者們通過對于單細胞樣品的成像，證實了他們的顯微鏡具有多色、三維、全細胞成像能力。對于各種不同的細胞器，如微管、聯會附合體、高爾基體、內質網、線粒體等都具有很好的成像效果。如圖2所示是他們對于高爾基體-囊泡的多色成像結果，從中可以很好地區分出高爾基體的層狀結構。

　　圖 2 對于HeLa細胞中高爾基體（Golgi Apparatus）和囊泡（COPI Vesicle）的成像結果。其中，綠色和洋紅色分別為經過免疫熒光標記的GM130和βCOP蛋白。圖a和b展示了同一成像區域的兩個側向切面。

　　相對于單細胞樣品，對于組織切片樣品的成像則更具有挑戰性。由于組織樣品的折射率分布更加復雜，大大增加了光散射背景噪聲和像差。同時，為了避免壓縮失真，組織切片的厚度需要達到單細胞樣品的厚度，則使得高分辨率成像變得尤其困難。在本文之前，尚沒有任何利用4Pi超分辨顯微鏡對于組織成功成像的報道。作者們利用他們開發的顯微鏡對于果蠅卵內的環溝（Ring Canal，也被稱為胞質橋Cytoplasmic Bridge）進行了成像。成像結果（如圖3所示）清晰顯示了環溝上的HtsRC和F-actin蛋白在空間分布和數量上的巨大差異，為進一步揭示其關聯功能提供了可靠的依據。此外，作者還利用相同的技術，對神經突觸進行了成像，并進一步測量了前后突觸蛋白Bassoon和Homer1之間的距離和統計分布，證實了他們顯微鏡在解決生物問題時的定量分析能力。

　　圖 3 單個果蠅卵環溝的成像結果。圖中，綠色和洋紅色分別為經過免疫熒光標記的HtsRC和F-actin蛋白。

　　由本文作者們所建立的自適應光學策略以及基于該策略所開發的超分辨顯微成像技術，不僅拓展了原有技術的應用范圍，而且對于整個4Pi顯微成像技術具有普適性，為更多生物學家使用4Pi超分辨顯微成像技術解決自身感興趣的科研問題提供了可能。此外，該技術路線也為探索更具突破性的顯微光場調控方法，如多焦點并行探測技術，提供了很好的啟迪。

　　本文的共同第一作者是現任浙江大學光電科學與工程學院研究員的郝翔博士、牛津大學的Edward S. Allgeyer博士和耶魯大學的Dong-Ryoung Lee博士，本文的通訊作者是耶魯大學的Joerg Bewersdorf教授。