第三代DNA測序技術

測序技術在近兩三年中又有新的里程碑。以PacBio公司的SMRT和Oxford Nanopore Technologies納米孔單分子測序技術，被稱之為第三代測序技術。與前兩代相比，他們最大的特點就是單分子測序，測序過程無需進行PCR擴增。

其中PacBio SMRT技術其實也應用了邊合成邊測序的思想5，并以SMRT芯片為測序載體。基本原理是： DNA聚合酶和模板結合,4色熒光標記 4 種堿基（即是dNTP）,在堿基配對階段,不同堿基的加入,會發出不同光,根據光的波長與峰值可判斷進入的堿基類型。同時這個 DNA 聚合酶是實現超長讀長的關鍵之一,讀長主要跟酶的活性保持有關,它主要受激光對其造成的損傷所影響。PacBio SMRT技術的一個關鍵是怎樣將反應信號與周圍游離堿基的強大熒光背景區別出來。他們利用的是ZMW（零模波導孔）原理：如同微波爐壁上可看到的很多密集小孔。小孔直徑有考究,如果直徑大于微波波長,能量就會在衍射效應的作用下穿透面板而泄露出來，從而與周圍小孔相互干擾。如果孔徑小于波長,能量不會輻射到周圍，而是保持直線狀態（光衍射的原理）,從而可起保護作用。同理,在一個反應管(SMRTCell:單分子實時反應孔)中有許多這樣的圓形納米小孔, 即 ZMW(零模波導孔),外徑 100多納米,比檢測激光波長小(數百納米),激光從底部打上去后不能穿透小孔進入上方溶液區,能量被限制在一個小范圍(體積20X 10-21 L)里,正好足夠覆蓋需要檢測的部分,使得信號僅來自這個小反應區域,孔外過多游離核苷酸單體依然留在黑暗中,從而實現將背景降到最低。另外，可以通過檢測相鄰兩個堿基之間的測序時間，來檢測一些堿基修飾情況，既如果堿基存在修飾，則通過聚合酶時的速度會減慢，相鄰兩峰之間的距離增大，可以通過這個來之間檢測甲基化等信息（圖）。SMRT技術的測序速度很快，每秒約10個dNTP。但是，同時其測序錯誤率比較高（這幾乎是目前單分子測序技術的通病），達到15%,但好在它的出錯是隨機的，并不會像第二代測序技術那樣存在測序錯誤的偏向，因而可以通過多次測序來進行有效的糾錯。

PacBio SMRT測序原理