精準醫學時代免疫微環境分子分型及免疫治療耐藥機制

　　免疫治療是晚期實體瘤治療的重要手段之一。經過幾十年的長足發展，歷經了腫瘤細胞因子治療[包含白介素、干擾素、胸腺法新（即胸腺肽α1）等]、腫瘤疫苗治療、細胞免疫治療以及免疫檢查點治療幾個階段。近年來，腫瘤免疫治療取得了重大進展，《科學》雜志將腫瘤免疫治療列為“2013年十大科學突破”首位，尤其以PD-1/PD-L1負性檢查點為代表的單克隆抗體，在晚期實體瘤治療中取得巨大成功。截至目前為止，已有Pembrolizumab（PD-1單抗）和Nivolumab（PD-1單抗）獲FDA批準用于治療惡性黑色素瘤、非小細胞肺癌、腎癌及頭頸部腫瘤，Atezolizumab（PD-L1單抗）、Durvalumab（PD-L1單抗）均獲批用于治療泌尿系上皮腫瘤、非小細胞肺癌等瘤種。同時，在全球范圍內，還有數千個免疫治療相關的臨床研究正如火如荼地開展。免疫治療正改變著惡性腫瘤的治療策略。但不可否認的是，單藥PD-1/PD-L1單抗治療的有效率仍然較低。例如，針對非選擇性人群，單藥PD-1單抗在晚期非小細胞肺癌的客觀有效率為19-22%，在晚期惡性黑色素瘤中為25-35%，在晚期腎癌患者中約為25%，而在晚期頭頸部鱗癌及肝癌中則分別為14%、15%左右。因此，如何進一步篩選優勢人群，或針對特定人群優化免疫聯合策略，是在精準醫學時代背景下亟需回答的問題，也是現階段免疫治療研究的一大熱點。

　　目前，FDA已批準兩個免疫治療相關靶標用于優勢人群篩選：一是PD-L1表達豐度，利用免疫組化技術，對微環境中腫瘤細胞及浸潤性免疫細胞的PD-L1表達水平進行檢測，主要應用于晚期非小細胞肺癌及胃癌的PD-1單抗靶標預測；另一個是錯配修復蛋白及微衛星不穩定（Mismatch repair/microsatellite instability，MMR/MSI）的檢測。2017年一項全球多中心單臂臨床研究數據顯示，在149例MSI-H/dMMR的泛瘤種患者中，Pembrolizumab的客觀有效率達39.6%。基于該數據，FDA批準Pembrolizumab用于晚期實體瘤合并MSI-H/dMMR的患者的二線治療。然而，在臨床實際應用當中，這兩個靶標仍然存在諸多瓶頸。首先，dMMR在多數晚期實體瘤中發生率較低，例如，在晚期結直腸癌中發生率為5-8%，晚期胃癌中為3-5%，而晚期肺癌中僅不到2%，這導致了該靶標獲益人群的局限；另外，有研究結果顯示，即使在PD-L1強陽性（超過50%腫瘤細胞陽性）的晚期非小細胞肺癌患者中，PD-1單抗（作為一線治療）的客觀有效率為44.2%；在PD-L1陽性（超過1%腫瘤細胞陽性）的晚期胃癌三線治療中，有效率僅為22.2%。也就是說，即使經過PD-L1的陽性選擇，PD-1單抗仍對一大部分患者無效。因此，想要突破上述瓶頸，進一步細化免疫分型、深入研究耐藥機制則是當下至關緊要的任務。

　　1、細化微環境的免疫分型。大量循證醫學證據證實，切實有效的分子分型是指導精準治療的基礎。腫瘤微環境涉及要素眾多、關系復雜，腫瘤細胞得以擺脫免疫系統的監控識別、逃離T細胞的殺傷，離不開諸多要素的共同作用：如成纖維細胞和巨噬細胞從抑制生長狀態被腫瘤細胞馴化為促瘤狀態（如TAMs分泌大量的蛋白酶、細胞因子和生長因子促進腫瘤生長）；MDSCs和Treg擾亂DCs抗原遞呈，抑制T細胞和B細胞增殖活化和NK細胞的毒殺作用，干擾腫瘤微環境的免疫平衡；另外，靜息狀態下，多數腫瘤細胞在蛋白水平不表達或低表達PD-L1，僅當效應性T細胞浸潤至腫瘤組織、釋放IFN-γ并作用于腫瘤細胞后，才通過一系列的分子信號途徑誘導PD-L1表達上調，進而介導獲得性免疫耐受的發生。因此，腫瘤微環境中，對免疫治療產生顯著影響的核心要素是：1.特異性殺傷T細胞的浸潤豐度；2.依賴于IFN-γ通路的PD-L1表達情況，以及各種活化性分子的下調表達、抑制性分子上調表達；3.各種抑制性T細胞的活化及清除。

　　陳列平教授團隊2012年即提出，聯合檢測腫瘤浸潤性淋巴細胞（Tumor Infiltrating Lymphocyte，TIL）及腫瘤微環境中的PD-L1，能夠優化對PD-1單抗的療效預測。基于這兩個指標，可以將腫瘤患者初步分為四個亞型：Type I：獲得性免疫耐受型（TIL+， PD-L1+），這種類型理論上是免疫治療，特別是PD-1/PD-L1抑制劑起效的理想分型；Type II：免疫無反應型（TIL-， PD-L1-），這種類型是預后最差的一種分型，通常需要采用多種策略的聯合治療來誘發患者的免疫反應；Type III：原發誘導表達型（TIL-， PD-L1+），該類型臨床少見，各個瘤種不一致，PD-L1表達不依賴于經典的IFN-γ途徑，往往通過原癌基因的活化導致PD-L1的固有表達，前期研究表明這種類型往往對PD-1/PD-L1抑制劑的療效不敏感；Type IV：其他通道逃逸型（TIL+， PD-L1-），針對這一類型目前臨床應用討論很不一致，其牽涉到PD-L1的的時間空間異質性，理論上，該腫瘤的免疫逃逸是依賴于其他的抑制性分子產生，需要今后更多的免疫檢查點通路抑制劑的臨床驗證。

　　盡管該分型實現了免疫細胞及分子層面的進一步細化，但仍然存在一些問題迫切需要解決：第一，PD-L1蛋白表達的時間、空間的抑制性以及各個公司采用的抗體并不一致，導致目前PD-L1檢測存在分歧。例如，Pembrolizumab采用22C3伴隨檢測抗體，Nivolumab采用28-8作為伴隨檢測抗體，Atezolizumab采用SP142作為伴隨檢測抗體，而Durvalumab采用SP263作為伴隨檢測抗體，臨床上各種針對PD-L1檢測的解讀鋪天蓋地，非腫瘤專科醫生往往很難甄別，目前在肺癌領域，正在發起多中心的病理協作，制定以及比對各個抗體之間的特異性以及敏感性差異，解決臨床現今檢測的瓶頸；第二，針對TIL細胞的分類需要進一步細化，而不同類型的TIL浸潤對預后指導意義大不相同；第三，針對TIL的計數評分常采用主觀的二級半定量評分，可重復性不高，不同中心、不同病理師的閱片判讀結果不容易達成一致；第四，常規方法難以滿足腫瘤微環境分析的要求，如：蛋白印記和流式細胞學的方法丟失了腫瘤的形態信息；分子水平的檢測（一代、二代測序、qPCR）能夠分辨出足夠多的基因型或細胞型組分，但無法判斷這些組分在組織原位的空間位置關系，而這種定位關系對理解其在微環境中的作用又是至關重要的；常規免疫組化方法無法分辨足夠多的細胞表型。綜合以上，目前迫切需要開發出針對腫瘤微環境的多分子標記景觀分析系統，同時建立每個分子的標準化檢測流程，滿足目前臨床對免疫微環境的關鍵分子標記物需要定位、定量、定性分析的需求，同時還必須滿足可重復性。例如，目前人工智能在數字化病理上探索應用，以及目前免疫評分體系在腸癌、肺癌以及乳腺癌的初步建立，都是對目前腫瘤免疫微環境分型的一個極大推動。

　　2、原發耐藥的機制探索。免疫治療原發耐藥包含腫瘤細胞本身固有因素以及腫瘤細胞外部因素。固有因素包括：異常基因突變頻率及總突變負荷；腫瘤抗原表達的缺失；原癌基因活化（EGFR、KRAS、MAPK，PI3K、WNT等）導致PD-L1的固有表達；腫瘤本身缺乏有效的抗原呈遞系統；腫瘤本身缺乏主要組織相容性復合體（MHC）的表達；IFN-γ信號途徑的異常突變導致腫瘤對殺傷性T細胞的不敏感等（見圖1）。而外部因素包括：腫瘤微環境中缺乏殺傷性T細胞浸潤； CTLA-4和其他免疫檢查點的異常活化；T細胞衰竭和表型變化；免疫抑制性細胞群（Treg，MDSC，II型巨噬細胞）以及腫瘤微環境中細胞因子和代謝產物釋放（CSF-1，色氨酸代謝物 ，TGF-β，腺苷）對免疫微環境產生的抑制效應（見圖2）。

　　對于上述復雜過程，如何發現、干預并深入挖掘其機制，是現階段巨大的挑戰。需要基礎醫學、轉化醫學以及臨床醫生的深入合作探索。通常目前認為，免疫治療各個環節的多策略聯合治療是逆轉耐藥的有效方法，如化療、放療與PD-1/PD-L1抑制劑的聯合使用，特別是局部放射治療逆轉耐藥目前已經有諸多研究報道；腫瘤新抗原疫苗不僅可以協同PD-1/PD-L1增效，同時有逆轉其耐藥的理論基礎；不同免疫檢查點抑制劑的聯合治療，比如CTLA-4聯合PD-1/PD-L1抑制劑，目前已有成熟的報道，而IDO抑制劑、OX40激動劑等正在進行臨床研究；抗血管生成聯合免疫治療也有大量的臨床研究正在開展；另外從機制上看，胸腺法新可以增強腫瘤抗原提呈作用，同時還可以促進腫瘤細胞表面MHC的表達，從而增強T細胞對腫瘤細胞的識別，改變腫瘤微環境，從而在一定程度上逆轉耐藥。有臨床前的動物模型研究表明，PD-1抗體聯合胸腺法新對荷瘤小鼠肝細胞癌皮下移植瘤有一定的協同作用，胸腺法新可能增強PD-1抗體的腫瘤抑制作用。

　　此外，對腫瘤、血液及其他樣品采取基線和動態分析模式，可以幫助我們為現階段及今后的深入研究作好準備。腫瘤微環境的基線評估通常包含對血液或組織樣本的總突變負荷、驅動基因突變情況以及多基因表達的綜合分析，也包括對CD8+T細胞的PD-L1、TCR表達情況及克隆能力的分析。而在治療前后（治療前、治療早期和進展時間點）對新鮮連續人類標本（腫瘤，血液，血清和微生物組）進行縱向動態評價，則有可能通過深度分析揭示治療抗性的潛在機制（見圖3）。這種基線和動態的分析方法超越了對靜態時間點的常規分析，并能通過動態評估癌癥應答尋找優異的預測性生物標志物。因此，它將成為臨床及轉化基礎研究中，深入揭示免疫檢查點抑制劑反應及耐藥機制的重要手段。