紫外吸收法測定核酸濃度與純度

實驗概要

學習測定DNA或RNA的濃度與純度。

實驗原理

核酸分子中的堿基集團含有共軛雙鍵，它們對紫外光有強烈的吸收。核酸的最大吸收波長在260 nm，吸收低峰在230 nm。可以利用核酸的這一特性對其濃度進行測定。在波長260 nm下，A260=1時，雙鏈DNA的含量為50 μg/ml，單鏈DNA為 33 μg/ml ，RNA為 40 μg/ml，寡聚核苷酸為 20～30 μg/ml。測出核酸溶液在A260的值，即可得出濃度。
 

根據經驗數據，純得DNA A260/A280=1.8,純的 RNA A260/A280=2.0.若樣品中含有蛋白或其它雜質會使其比值下降。

主要試劑

TE緩沖溶液

主要設備

紫外分光光度計

實驗材料

DNA

實驗步驟

1、開機，選擇波長

開機前應先檢查光路中有無障礙物。然后開啟電源開關預熱20左右。并調節波長在260 nm下。
 

2、選擇A檔，調零

面表上有4個可供選擇的模式，本實驗選擇測定A值，因此選擇A模式。待測核酸為水或TE溶液，選擇水或TE做空白對照進行調零。

3、測定樣品

將待測樣品做適當稀釋，用儀器配套的石英比色杯，以水或TE為對照的條件下測定，讀取并記錄樣品A260的值。

4、計算樣品的濃度

雙鏈DNA濃度=50μg/ml×A260×稀釋倍數

單鏈DNA濃度=33μg/ml×A260×稀釋倍數

單鏈RAN濃度=40μg/ml×A260×稀釋倍數

核酸總量=樣品濃度×樣品體積（ml）