純化DNA實驗

細胞

TBS 抽提緩沖液

離心管

1. 根據樣品類型，從下列方法中選一個作為步驟 1 進行操作。

(1) 細胞樣品

① 單層培養的細胞

以用冰預冷的 TBS 將單層細胞洗滌 2 次，用刮棒把細胞刮入約 0.5 ml 的 TBS 中，將細胞懸液轉移到冰浴的離心管中，用 1 ml TBS 沖洗培養皿，并入離心管中的細胞懸液。于 4℃ 以 1500 g 離心 10 分鐘以收獲細胞。用 5~10 倍體積經冰預冷的 TBS 重懸細胞并再度離心。用 TE ( pH 8.0）重懸細胞，使細胞密度為 5x10⁷ 細胞/ml，轉移至一個三角燒瓶中（1 ml 細胞懸液用 50 ml 燒瓶；2 ml 則用 100 ml 燒瓶；余類推）。每毫升細胞懸液加入 10 ml 抽提緩沖液，在 37℃ 孵育 1 小時，隨后進行步驟 2。

抽提緩沖液：

10 mmol/L Tris-HCl，pH 8.0

0.1 mol/L EDTA，pH 8.0

20 ug/ml 胰 RNA 酶

0.5% SDS

② 懸浮生長的細胞

于 4℃ 以 1500 g 離心 10 分鐘以收獲細胞。用與原培養液等體積的經過冰預冷的 TBS 重懸細胞，再次離心收獲細胞并重復洗滌步驟。用 pH 8.0 的 TE 重懸細胞使密度為 5x10⁷ 細胞/ml。將懸液轉移至大小適當的燒瓶中，依前聽述加入抽提緩沖液并孵育。

(2) 組織標本

將剛切制的組織碎塊放到盛有液氮的 Waring 絞切器的不銹鋼杯中，以最高速度絞切至組織粉碎成為粉末。待液氮蒸發，將組織碎末一點一點地加入到盛有近 10 倍體積抽提緩沖液（如前）的燒杯中。使粉末分散在抽提緩沖液的表面，面后振搖燒杯使粉末浸沒。待其完全分散于溶液中后，將該溶液轉移至 50 ml 離心管中，37℃ 孵育 1 小時。隨后進行步驟 2。

(3) 血液標本

收集約 20 ml 新鮮血液，加入裝有 3.5 ml 酸性檸檬酸葡萄糖溶液 B ( ACD ) 的試管中 。這一抗凝劑優于 EDTA，因為它在血液貯存過程中更能保存高分子量 DNA。這些血液在制備 DNA 前可于 0℃ 保存數天或于 -70℃ 長期保存。配制 ACD 時，混合：

檸檬酸              0.48 g

檸檬酸鈉          1.32 g

葡萄糖             1.47 g

加水至 100 ml

用作抗凝劑時，每 6 ml 新鮮血液中加入 1 ml ACD。

新鮮血液（20 ml）：以 1300 g 離心 15 分鐘，棄上層血漿，用巴斯德吸管將淡黃層小心移到另一管中并再次離心。淡黃層即為密度不均一的白細胞寬帶。將經第二次離心的淡黃層重懸于 15 ml 抽提緩沖液中，37℃ 孵育 1 小時，隨后進行步驟 2。

凍藏血液（20 ml）：在室溫水浴中融化，移至離心管中，用等體積 PBS 稀釋；隨后于室溫以 3500 g 離心 15 分鐘并棄去上清液，其中含有已溶解的紅細胞用 15 ml 抽提緩沖液重懸沉淀物；37℃ 孵育 1 小時，隨后進行步驟 2。

2. 蛋白酶 K 至終濃度為 100 ug/ml，用玻棒溫和地將酶混入黏稠的溶液中。

3. 裂解細胞的懸液置于 50℃ 水浴中 3 小時，不時懸動該黏稠溶液。

4. 溶液冷卻至室溫，如有必要就將溶液倒入離心管。加等體積經 0.5 mol/L Tris-HCl（pH 8.0）平衡的酚，緩慢地來回顛倒離心管 10 分鐘以輕輕地混合兩相 。如此時兩相未能混合形成乳濁液，則將離心管置于旋轉器上 1 小時，于室溫以 5000 g 離心 15 分鐘，使兩相分開。

5. 大口徑移液管（出口直徑為 0.3 cm ) 將黏稠的水相移至一潔凈的離心管中并用酚重復抽提 2 次。

6. 分離高分子量 DNA ( 約 200 kb )：第三次酚抽提后用全部水相于 4℃ 對 4 L 50 mmol/L Tris-HCl ( pH 8.0)、10 mmol/L EDTA ( pH 8.0 ) 溶液透析 4 次，直至透析液的 OD₂₇₀ 值小于 0.05。讓透析袋留有使樣品體積增至 1.5~2.0 倍體積的空間。下轉步驟7。

分離大小為 100~150 kb 的 DNA：第三次酚抽提后，將全部水相移至另一離心管中并加 0.2 倍體積的 10 mol/L 乙酸銨。在室溫下加 2 倍體積乙醇并轉動離心管使溶液充分混合。DNA 立即形成沉淀，通常可用制成 U 形并經封口的巴斯德吸管將沉淀從乙醇溶液中移出。而大部分污染的寡聚核糖核苷酸仍留在乙醇溶液中。如果 DNA 沉淀成為碎片，則在吊桶式轉頭中于室溫以 5000 g 離心 5 分鐘收集 DNA。用 70% 乙醇洗滌 DNA 沉淀 2 次，并按上述條件離心收集 DNA。盡可能徹底地除去 70% 乙醇，于室溫將 DNA 沉淀置于一個敞幵的管內，直至可見的痕量乙醇揮發殆盡。不要使 DNA 沉淀完全干燥，否則極難溶解。

大約按每 5x10⁶ 細胞加 1 ml TE (pH 8.0 )。將管子放在搖床平臺上慢慢搖動直至 DNA 完全溶解。這通常需要 12~24 小時。

7. 測定 DNA 樣品在 260 nm 和 280 nm 處的光吸收。A₂₆₀ 與 A₂₈₀ 之比應大于 1.75。低于此值則表明制備物中留有大量蛋白質。在這種情況下，應加入 SDS 至終濃度為 0.5%，并重復步驟 2~7。

8. 計算 DNA 濃度，進行脈沖電場凝膠電泳或通過鋪在 1% 瓊脂糖支持層上的 0.3% 瓊脂糖凝膠電泳分析小量樣品。大于 100 kb 的 DNA，其遷移率應該比完整的 λ 噬菌體 DNA 的線性二聚體分子慢。將 DNA 貯存在 4℃。

參考《細胞實驗指南》第3章