粒體內膜含有比外膜更多的蛋白質，所以承擔著更復雜的生化反應。存在于線粒體內膜中的蛋白質主要可分為如下幾類，它們分別負責不同的生理過程：
運輸酶與載體蛋白：運輸酶可進行各種代謝產物和中間產物的運輸。此外，內膜中還有一些特異性載體蛋白，運輸鈣離子、磷酸、谷氨酸、鳥氨酸及核苷酸等。
生物大分子合成酶類：完成某些重要生物合成的酶。線粒體是線粒體DNA和線粒體RNA等生物大分子合成的場所。
參與電子傳遞和ATP合成的酶類：這類酶是線粒體內膜的主要成分，參與電子傳遞和三磷酸腺苷（adenosine triphosphate，簡稱“ATP”）的合成。
控制線粒體分裂與融合的蛋白質。