線粒體的超活染色與觀察

實驗簡介：線粒體是機體能量代謝的重要細胞器。本實驗以肝細胞、人口腔上皮細胞、洋蔥鱗莖內表皮細胞三種材料為實驗對象，通過詹納斯綠B 專一性地對線粒體進行超活染色，可使線粒體內中的細胞色素氧化酶系呈藍綠色反應，而線粒體周圍的細胞質呈無色反應，由此作為線粒體的特異性特征。實驗學時3 個。

一、實驗目的
1. 觀察動、植物活細胞內線粒體的形態、數量與分布。
2. 學習一些細胞器的超活染色技術。

二、實驗原理
活體染色是指對生活有機體的細胞或組織某些結構能著色但又不影響細胞的生命活動和產生任何物理化學變化以致引起細胞的死亡的一種染色方法。因此活染技術通常可用來研究生活狀態下的細胞形態結構和生理、病理狀態。根據所用染色劑的性質和染色方法的不同，通常把活體染色分為體內活染與體外活染兩類。體內活染是以膠體狀的染料溶液注入動、植物體內，染料的膠粒固定、堆積在細胞內某些特殊結構里，達到易于識別的目的。體外活染又稱超活染色，它是由活的動、植物分離出部分細胞或組織小塊，以染料溶液浸染，染料被選擇固定在活細胞的某種結構上而顯色。
詹納斯綠B 是毒性較小的堿性染料，可專一性地對線粒體進行超活染色，這是由于線粒體內的細胞色素氧化酶系的作用，使染料始終保持氧化狀態(即有色狀態)，呈藍綠色；而線粒體周圍的細胞質中，這些染料被還原為無色的色基(即無色狀態)。

三、實驗材料
（一）材料 肝細胞、人口腔上皮細胞、洋蔥鱗莖內表皮細胞
（二）器材 顯微鏡、恒溫水浴鍋、解剖盤、剪刀、表面皿、吸管、牙簽、吸水紙。

（三）試劑
1．Ringer 溶液
NaCl 0.85g
KCl 0.25g
CaCl2 0.03g
蒸餾水 100ml
2. 1%詹納斯綠B 溶液（原液）
稱取50mg 詹納斯綠B 溶于5ml Ringer，稍加微熱(30～40℃)，使之溶解，用濾紙過濾后，即為1％原液。
3. 詹納斯綠B 溶液（應用液）
取1％原液1ml 加入49ml Ringer 溶液, 混勻即可。現用現配。

四、實驗操作
1. 人口腔粘膜上皮細胞線粒體的超活染色觀察
(1) 取清潔載玻片放在37℃恒溫水浴鍋的金屬板上，滴2 滴詹納斯綠B 應用染液。
(2) 實驗者用牙簽寬頭在自己口腔粘膜處稍用力刮取上皮細胞，將刮下的粘液狀物放入載玻片的染液滴中，染色10～15min(注意不可使染液干燥，必要時可再加滴染液)，蓋上蓋玻片，用吸水紙吸去四周溢出的染液，置顯微鏡下觀察。
(3) 在低倍鏡下，選擇平展的口腔上皮細胞，換高倍鏡或油鏡進行觀察。
可見扁平狀上皮細胞的核周圍胞質中，分布著一些被染或藍綠色的顆粒狀或短棒狀的結構，即是線粒體。
2. 小白鼠肝細胞線粒體的超活染色觀察
(1) 用脊椎脫臼法處死小白鼠，置于解剖盤中，剪開腹腔，取小白鼠肝邊緣較薄的肝組織塊，放入表面皿內。用吸管吸取Ringer 液，反復浸泡沖洗肝臟，洗去血液。
(2) 在干凈的凹面載玻片的凹穴中, 滴加詹納綠B 應用液，再將肝組織塊移入染液，注意不可將組織塊完全淹沒，要使組織塊上面部分半露在染液外，這樣細胞內的線粒體表面可充分得到氧化，易被染色。當組織塊邊緣被染成藍綠色即成(—般需染20～30min)。

(3) 吸去染液，滴加Ringer 溶液，用眼科剪將組織塊著色部分剪碎，使細胞或細胞群散出。然后，用吸管吸取分離出的細胞懸液，滴一滴子載玻片上，蓋上蓋玻片進行觀察。
(4) 在低倍鏡下選擇不重疊的肝細胞，在高倍鏡或油鏡下觀察，可見具有l～2 個核的肝細胞質中，有許多被染成藍綠色的線粒體，注意其形態和分布狀況。
3. 洋蔥鱗莖表皮細胞線粒中的超活染色觀察
(1) 用吸管吸取詹納斯綠B 應用染液，滴一滴于干凈的載破片上，然后撕取一小片洋蔥鱗莖內表皮，置于染液中，染色10～15min。
(2) 用吸管吸去染液，加—滴Ringer 液，注意使內表皮組織展平，蓋上蓋玻片進行觀察。
(3) 在高倍鏡下，可見洋蔥表皮細胞中央被一大液泡所占據、細胞核被擠至—側細胞壁處。細觀察細胞質中線粒體的形態與分布。