細胞和亞細胞提取物的制備實驗

實驗方法原理 對于細胞內蛋白的純化和特性分析，重要的是選擇一種有效的方法來破碎細胞或組織，使蛋白迅速地從胞內相對隔離的空間中釋放到緩沖液中，而該緩沖液應對所研究的蛋白的生物活性沒有影響。廣泛使用的破碎軟組織的方法之一是勻漿。

在本方案中，討論了使用機械力勻漿組織：在 Potter-Elvehjemglass-Teflon 勻漿器 (見圖 3.1)、Dourxce 手動勾裝器或便攜式韋林攬切器（Hand-heldWaringBlender) 中切碎組織的三種程序。這些方法快速、安全，且蛋白酶從其他的細胞區隔中釋放出來的風險很小。可以通過在勻漿緩沖液中加人蛋白酶抑制劑來降低蛋白酶的水解作用。

實驗材料 合適的動物組織

試劑、試劑盒 二硫蘇糖醇勻漿緩沖液A勻漿緩沖液B苯甲基磺酰氟

儀器、耗材 離心機粗棉布和過濾漏斗 切刀或絞肉機勻漿均化器

實驗步驟

要點：所有操作均在 0~4°C 進行。

1.從動物中取出組織后，修剪并去除脂類和結締組織，然后放入預冷的勻漿緩沖液 A 中。

2.用切刀把洗好的組織切成小塊（如 1cm 方塊），或者把這些組織放在絞肉機上攪兩次。

像肝臟、大腦、腎和心臟等組織很容易在韋林攪切器中破碎，但是骨骼肌和肺則很難，所以應在勻漿之前先用家用絞肉機來絞碎。許多纖維組織，比如哺乳動物胸腺，必須在勻漿之前冰凍以利于破碎（常用 Ultra-Turrex 勻漿器）。培養的哺乳動物細胞和少量的軟組織（1~5 g)，比如腦，可以使用 Dunce 手動勻架器（Dignam,1990) 來勻漿。在所有情況下，都要 4°C 預冷勻漿器和玻璃容器，并且勻漿操作應該在冷室中進行。

3.將組織加入 3~4 倍體積的勻漿緩沖液 B 中，然后轉移到勻漿器中。

4.使用下面的方法來制備勻漿液。

Potter-Elvehjem 勻漿器：儀器設置在 500~1500r/min，勻漿組織數次，每次 5~10s。

Dounce 手動勻漿器：勻漿組織 10~20 次。

韋林攪切器：勻漿組織 3~4 次，每次 20~30s，間隔 10~15s。

5.把勻漿液倒入玻璃燒杯，把燒杯放在冰上，在 4°C 條件下溫和攪動勻漿液 30~60 min，以便充分提取蛋白。

實驗提示：勻漿過程中不要起泡。

6.4°C 條件下 10000g 離心 10~20 min，除去勻漿液中的細胞碎片和其他物質。

7.過濾漏斗中鋪兩層紗布（或加一層玻璃棉）來過濾上清，除去漂浮在表面的脂類物質。小心地擰紗布以便獲得最大量的濾液（稱為「粗提液」）。

8.盡快用適當的分離方法和分析方法處理樣品。