| 實驗方法原理 | Caspase家族在介導細胞凋亡的過程中起著非常重要的作用，其中caspase-3為關鍵的執行分子，它在凋亡信號傳導的許多途徑中發揮功能。Caspase-3正常以酶原（32KD）的形式存在于胞漿中，在凋亡的早期階段，它被激活，活化的Caspase-3由兩個大亞基（17KD）和兩個小亞基（12KD）組成，裂解相應的胞漿胞核底物，最終導致細胞凋亡。但在細胞凋亡的晚期和死亡細胞，caspase-3的活性明顯下降。 |
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| 實驗材料 | 細胞 |
| 試劑、試劑盒 | 磷酸緩沖液 蒸餾水 脫脂奶粉 Caspase-3多抗 吐溫 Ac-DEVD-AMC |
| 儀器、耗材 | 硝酸纖維素膜 PVDF膜 熒光分光光度計 UV流式細胞計 燒杯 移液管 引流棒 |
| 實驗步驟 |
1、收集細胞； 2、PBS洗滌； 3、抽提細胞裂解液； 4、蛋白定量； 5、SDS-PAGE電泳，硝酸纖維素膜或PVDF膜轉移，5%脫脂奶粉封閉，室溫1.5——2h或4°C過夜； 6、Caspase-3多抗或單抗室溫反應1——2h或4℃過夜，TBS-T（含0.05% Tween 20的TBS）洗3次，5——10min/次； 7、HRP-標記的羊抗鼠IgG或AP標記的羊抗鼠IgG室溫反應1——2h→ TBS-T洗3次， 5——10min/次； 8、ECL顯影或NBT/BCIP顯色。
展開 |
| 注意事項 |
1. 整個操作動作要盡量輕柔，勿用力吹打細胞； 2.反應完畢后盡快在一小時內檢測。
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| 其他 |
1. 結果采用Western blot 分析Procaspase-3的活化，以及活化的Caspase-3及對底物多聚（ADP-核糖）聚合酶[poly（ADP-ribose）polymerase，PARP]等的裂解。 2. 此外還有熒光分光光度計和流式細胞術分析法。
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