細胞凋亡的分子生物學檢測方法(2)

2、色缸中加入含2％過氧化氫的PBS，于室溫反應5min。用PBS洗兩次，每次5min。

3、用濾紙小心吸去載玻片上組織周圍的多余液體，立即在切片上加2滴 TdT酶緩沖液，置室溫1～5min。

4、用濾紙小心吸去切片周圍的多余液體，立即在切片上滴加 54μl TdT酶反應液，置濕盒中于37C反應 1hr（注意：陰性染色對照，加不含TdT酶的反應液）。

5、將切片置于染色缸中，加入已預熱到37℃的洗滌與終止反應緩沖液，于37℃保溫30min，每10min將載玻片輕輕提起和放下一次，使液體輕微攪動。

6、組織切片用PBS洗 3次，每次 5min后，直接在切片上滴加兩滴過氧化物酶標記的抗地高辛抗體，于濕盒中室溫反應30min。

7、用PBS洗4次，每次5min。

8、在組織切片上直接滴加新鮮配制的0.05％DAB溶液，室溫顯色3～6min。

9、用蒸餾水洗4次，前3次每次1min，最后1次5min。

10、于室溫用甲基綠進行復染10min。用蒸餾水洗3次，前兩次將載玻片提起放下10次，最后1次靜置30s。依同樣方法再用100％正丁醇洗三次。

11、用二甲苯脫水3次，每次2min，封片、干燥后，在光學顯微鏡下觀察并記錄實驗結果。

[注意事項]

1、一定要設立陽性和陰性細胞對照。陽性對照的切片可使用DNaseI部分降解的標本，陽性細胞對照可使用地塞米松（1μM）處理3-4hr的大、小鼠胸腺細胞或人外周血淋巴細胞。陰性對照不加TdT酶，其余步驟與實驗組相同。

2、RNA操作中的一般要求

在所有RNA實驗中，最關鍵的因素是分離得到全長的RNA。而實驗失敗的主要原因是核糖核酸酶（RNA酶）的污染。由于RNA酶廣泛存在而穩定，一般反應不需要輔助因子。因而RNA制劑中只要存在少量的RNA酶就會引起RNA在制備與分析過程中的降解，而所制備的RNA的純度和完整性又可直接影響RNA分析的結果，所以RNA的制備與分析操作難度極大。在實驗中，一方面要嚴格控制外源性RNA酶的污染；另一方面要最大限度地抑制內源性的RNA酶。RNA酶可耐受多種處理而不被滅活，如煮沸、高壓滅菌等。外源性的RNA酶存在于操作人員的手汗、唾液等，也可存在于灰塵中。在其它分子生物學實驗中使用的RNA酶也會造成污染。這些外源性的RNA酶可污染器械、玻璃制品、塑料制品、電泳槽、研究人員的手及各種試劑。而各種組織和細胞中則含有大量內源性的RNA酶。防止RNA酶污染的措施包括：

1.所有的玻璃器皿均應在使用前于180℃的高溫下干烤6hr或更長時間。

2.塑料器皿可用0.1% DEPC水浸泡或用氯仿沖洗（注意：有機玻璃器具因可被氯仿腐蝕，故不能使用）。

3.有機玻璃的電泳槽等，可先用去污劑洗滌，雙蒸水沖洗，乙醇干燥，再浸泡在3% H2O2 室溫10min，然后用0.1% DEPC水沖洗，晾干。

4.配制的溶液應盡可能的用0.1% DEPC，在37℃處理12hr以上。然后用高壓滅菌除去殘留的DEPC。不能高壓滅菌的試劑，應當用DEPC處理過的無菌雙蒸水配制，然后經0.22μm濾膜過濾除菌。

5.操作人員戴一次性口罩、帽子、手套，實驗過程中手套要勤換。

6.設置RNA操作專用實驗室，所有器械等應為專用。

常用的RNA酶抑制劑

1.焦磷酸二乙酯（DEPC）：是一種強烈但不徹底的RNA酶抑制劑。它通過和RNA酶的活性基團組氨酸的咪唑環結合使蛋白質變性，從而抑制酶的活性。

2.異硫氰酸胍：目前被認為是最有效的RNA酶抑制劑，它在裂解組織的同時也使RNA酶失活。它既可破壞細胞結構使核酸從核蛋白中解離出來，又對RNA酶有強烈的變性作用。

3.氧釩核糖核苷復合物：由氧化釩離子和核苷形成的復合物，它和RNA酶結合形成過渡態類物質，幾乎能完全抑制RNA酶的活性。

4.RNA酶的蛋白抑制劑（RNasin）：從大鼠肝或人胎盤中提取得來的酸性糖蛋白。RNasin是RNA酶的一種非競爭性抑制劑，可以和多種RNA酶結合，使其失活。

5.其它：SDS、尿素、硅藻土等對RNA酶也有一定抑制作用。