細胞凋亡及其檢測技術2

（二）熒光法：
選用上述最佳濃度作用于腫瘤細胞，培養細胞48h后，收貨細胞用PBS洗2-3次后用0.4%多聚甲醛室溫下固定30min。
棄去固定液，并用PBS洗2次后，用1%Triton X-100作用4min加入適量的0.5mg/L DAPI熒光染色60min，用PBS沖洗3次，取10ul滴片，干燥后于熒光顯微鏡下檢測斷裂的顆粒和片狀熒光。
（三） DNA瓊脂糖凝膠電泳法：
1、DNA提取：
用大方瓶培養腫瘤細胞，每瓶10ml，細胞濃度為3 x 108個/ml，每隔藥物濃度、作用時間均設2瓶，共分3個時間段，4個藥物濃度。共培養26瓶細胞。
分別于細胞中加入不同濃度的藥物，于37℃、5% CO2中分別培養12h、24h、48h，收貨細胞，用PBS洗2-3次。

于-20℃將細胞冷卻處理10min后將細胞收集至離心管中，加1ml細胞裂解液，再加蛋白酶K，輕輕振搖使懸液混勻，成黏糊狀，50℃過夜。
冷卻后加入等體積的飽和酚溶液，混合后10000r/min離心10min，吸出上層水相，移至另一離心管中，再加入等體積飽和酚溶液重復抽提一次，直到無蛋白為止。
上清加入氯仿/異戊醇（24：1）按上述方法再抽提一次。
吸取水相層加入1/10體積的3mol/L的醋酸鈉溶液，混勻。
加入2.5倍體積冷無水乙醇，混合置-20℃處理30min后，10000r/min離心10min，沉淀部分為提供的DNA，棄去無水乙醇后用70%乙醇漂洗2次，將離心管倒扣在吸水紙上，吸干乙醇。
加入200ulTE緩沖液融解DNA，再加入25ul的RNA酶，置37℃作用30min，置4℃冰箱保存。
2、瓊脂糖凝膠電泳：
TBE緩沖液配制1.8%瓊脂糖凝膠。在微波爐內煮沸至瓊脂糖融解，待冷卻至60℃時，加入溴化乙錠，使其終濃度為0.5mg/ml，混勻后灌膠。
待凝膠固定后放入含TBE電泳液的電泳槽內，使TBE電泳液蓋過凝膠。
取10-15ul提取的各組DNA樣品液與上樣緩沖液按4：1比例混勻后點樣。
60V電泳1h，用紫外透射儀觀察梯形條帶，
（四）透射電鏡形態學觀察法：
收集藥物作用后最佳凋亡時期的凋亡腫瘤細胞，細胞總量大于10^6個，用PBS洗2遍后用3%戊二醛固定1h，PBS洗2次，再用1%鋨酸固定1h，丙酮酸梯度脫水。
細胞用樹脂包埋，并進行超薄切片，用醋酸鈉-枸櫞酸鉛染色，透射電鏡下觀察凋亡的細胞形態，可見有染色質濃集，不均勻分布，考核周邊形成有核膜包裹的斷裂核碎片，呈新月形凋亡小體，并選擇典型切片圖像攝影。
（五）流式細胞儀檢測法：
1、原理：
處于增殖周期中的細胞，根據其所處不同周期時相其DNA含量分布在2n-4n之間，發生凋亡的細胞內與核內DNA裂解成許多小片斷，用細胞膜通透法可使小分子量的DNA片斷穿過薄膜而丟失，僅剩下大分子量DNA片斷，這些失去部分DNA的細胞可形成一個DNA含量小于2n的分布區，稱“亞G1峰”，即AO峰（凋亡峰）。
2、特點：
經濟簡便，僅需單一染色。
可判斷凋亡細胞發生于哪一周期。
可定量測定凋亡率，結果客觀可信。
用同樣本可同時進行“亞G1峰”測定及DNA凝膠電泳。
3、方法步驟：
收貨不同劑量藥物作用于各不同時期的腫瘤細胞，細胞總數應大于10^6個，用PBS洗2次，加入70%酒精固定，4℃存放。
染色前用PBS離心沉淀去除固定液，并用PBS洗1-2次，加入200ulRNA酶，37℃水浴30min。

每毫升細胞懸液中加入碘化丙錠（PI）染液100ul混勻，置4℃避光30min，用流式細胞儀進行細胞周期分析，低于G1期DNA含量的細胞為凋亡細胞。測定“亞G1峰”值和細胞凋亡率。
除上述常用的方法外，還可采用：
ELISA法。其凋亡的斷裂核可與抗組蛋白抗體及抗DNA抗體混合物反應后形成雙抗體“夾心”結構，再經酶顯色也可判斷。
末端轉移的酶標記技術，利用核裂解碎片含有3/-OH的末端，在末端轉移酶作用下加入已標記的核苷酸，在3/-OH末端上合成一段含標記的尾巴，再經酶顯色或用熒光抗體顯示出來。

五、bcl-2凋亡基因表達的檢測
（一）原理：
細胞凋亡是一個受基因調控的主動過程，bcl-2是抑制細胞凋亡的原癌基因，正常細胞的激活和發育過程中都有表達，但在發育成熟的細胞中，其表達降低，在低分化或癌變的細胞中，bcl-2高表達與腫瘤的發生、發展相關，bcl-2過量表達常導致對化療藥物的耐藥性而阻止細胞凋亡，影響治療效果，一旦細胞發生凋亡，其bcl-2表達降低，甚至完全消失。
bcl-2家族由bcl-2、bcl-X、bax、mcl-1和A1組成。進行bcl-2基因表達的檢測有兩種，一種是用抗bcl-2蛋白抗體的流式細胞儀測定法，檢測細胞漿中的bcl-2蛋白量，另一種是采用RT-PCR法測細胞中bcl-2 mRNA的表達。
（二）方法：
1、bcl-2蛋白表達的檢測：
采用流式細胞儀和間接免疫熒光法測定細胞中bcl-2蛋白的量。
收集藥物不同劑量、不同作用時間的凋亡腫瘤細胞，用含2%小牛血清的PBS洗2次。
加入2%多聚甲醛室溫固定20min，再用PBS配制的Staing緩沖液洗滌。
1500r/min離心5min，棄上清，置-20℃存放過夜。
在凍存的細胞內加入1mlPBS配制的TB穿透液放置5min，用Staing緩沖液洗滌1次后，加2%滅活的人AB型血清1ml，37℃放10min。
加入bcl-2多抗工作液40ul，4℃孵育30min后，對照組不加多抗，隨后用PBS洗3次，5min 1次。
加入FITC熒光標記的二抗工作液40ml4℃孵育30min后，用PBS洗3次，用流式細胞儀檢測熒光強度（MFI）的變化，計算bcl-2陽性細胞表達率和bcl-2蛋白表達的平均熒光強度。