細胞凋亡小體和梯狀DNA的觀察(2)

四、實驗程序
       1． 取樣
　　1）直接撕取洋蔥內表皮和刮取人口腔上皮細胞
　　2）煙草懸浮細胞的培養 煙草(Nicotiana tabacum)懸浮細胞在改良的MS液體培養基（內含MS基本培養基, KH2PO4 200 mg/L，2，4-D 1 ml/L，Gly 1.8 mg/L，VB1 0.6 mg/L）中繼代培養，每7天繼代一次，培養基pH 5.8，110 rpm/min搖床振蕩，25℃懸浮培養。
       2．細胞凋亡的誘導
　　1）Cyt c處理：共做三組樣品。試驗組樣品要先經Cyt c處理，濃度為12.5 μmol/L，如實驗材料為人口腔上皮細胞，時間為1hr左右，如是洋蔥內表皮或煙草懸浮細胞時，時間控制為48hr左右；正對照樣品不需處理，為正常生長的細胞；負對照樣品是將正常的細胞煮沸30min，使其壞死。在具體做實驗時，也可以采用不同濃度的Cyt c進行處理：
　　（1） Cyt c誘導人口腔上皮細胞的凋亡步驟：
　　　　　①涂片；
　　　　　② 漂洗均參照細胞骨架實驗的操作；
　　　　　③處理：浸泡于三種不同濃度的Cyt C溶液中；
　　　　　④分別于1hr后分時間段取出，用改良苯酚染液染色30min；
　　　　　⑤鏡檢觀察。
　　（2）細胞色素C誘導的洋蔥內表皮細胞凋亡步驟：
　　　　　①將洋蔥內表皮切成1cm2的小塊，浸泡于三種不同濃度的Cyt C溶液中；
　　　　　② 48hr后用改良苯酚染液染色30min，洗去表面染料，放在載玻片并壓片；
　　　　　③鏡檢。
　　2） 高濃度Ca2+的處理：170 nmol/L或230 nmol/L 的CaCl2處理材料1hr左右，樣品操作方法同上。
       3． 形態學觀察
　　在顯微鏡下觀察細胞形態并對試驗組細胞進行凋亡率統計。隨機選取5個視野，統計總細胞數和凋亡細胞數（以細胞核染色質出現明顯的邊緣化凝集為標志），計算凋亡率（%）=（凋亡細胞數/總細胞數）×100%。最后在普通光鏡下照相。
       4． 基因組DNA的提取
　　對以上三組不同處理的樣品分別進行基因組DNA的提取（方法參見第一章，實驗2），并進行1% 瓊脂糖凝膠電泳的檢測。
五、 結果與分析
      1． 形態學變化
　　煙草懸浮細胞系BY-2的對照組細胞胞質透明，核圓形且周圍有許多顆粒狀物質分布，細胞多聚集成團（見圖8-2 A，C）。實驗組BY-2經12.5μmol/L Cyt c處理48hr后，顯微鏡下均可見細胞染色質明顯聚集在核膜邊緣、形成凋亡小體，細胞胞質內均勻分布著碎末狀物質，細胞分散均勻，不成團狀（見圖8-2 B,D）。在光鏡下可以觀察到高鈣誘導的細胞凋亡現象為，細胞核內染色體出現明顯的聚集現象，見圖8-3。
　　2． 瓊脂糖凝膠電泳結果
　　經細胞凋亡誘導的細胞，分別提取總DNA。然后經1%的瓊脂糖凝膠電泳，在紫外投射儀上觀察。經 Cyt c處理不同時間細胞的DNA出現了不同斷裂程度的DNA Ladder。