細胞凋亡的研究方法

Important notes：
Morphological data so far are most reliable and convincing evidence for apoptosis， especially with electromicroscopy
Morphological analysis should be included together with other parameters
Different methods may suit different cell types
The time-course of apoptotic events are important for selection of the methods
Flow cytometry is the most useful and powerful in apoptosis research
一、形態學研究方法 （Morphological methods）：
1、普通顯微鏡 ： 凋亡細胞變小、變形、細胞膜完整、發泡現象，晚期可見凋亡小體。
Giemsa 核染料：染色質濃縮、凋亡小體。
2、電子顯微鏡：細胞質濃縮、核變小、晚期核碎片成凋亡小體。
3、操作步驟 （Morphological methods）：
（1） 普通顯微鏡：將培養有細胞的24孔培養板于倒置顯微鏡下觀察，觀察經過誘導、和未誘導組的細胞形態、大小和細胞凋亡小體，照相記錄。
（2）電子顯微鏡：5x106 細胞，加25%戊二醛固定，再用1%哦酸固定，將細胞置于丙酮：包埋基（1 ：1）中2小時，切片，透射電鏡觀察。可見細胞膜完整，核變小，染色質濃縮并結塊/沿核膜內側排列，晚期核裂解為碎片產生凋亡小體。
二、生物化學研究方法：
1、原理：染色質核小體單位 斷裂 50~300kb，或180~200 bp整倍數片段（DNA ladder）。
2、設備：離心機、Agarose電泳裝置，X-底片，照相系統
3、步驟：
（1） 5 x 106 細胞，加裂解液，離心，酚 / 氯仿提取細胞DNA，Agarose電泳，EB染色，拍照。
（2） 細胞量很少時，可用32P-ATP加脫氧核糖核苷酸末端轉移酶（TdT）標記DNA，電泳、放射自顯影，觀察DNA ladder。
三、分子生物學研究方法：
1、TdT介導的缺口末端標記法（Terminal-deoxynucletidyl transferase mediated nick end labeling ， TUNEL）：
原理：染色質核小體單位 斷裂 50~300kb，30% 酶切成180~200 bp片段，3’-OH缺口可在TdT作用下將標記有熒光素、生物素、過氧化酶等的核苷標記到3’-末端。正常細胞DNA很少斷裂，很少被染色。
2、熒光素標記測定法：
（1）原理：地高辛-11-dUTP在TdT作用下 標記到3’-末端 。熒光素標記的地高辛抗體進行檢測。可在激發光494 nm時產生523nm的發射光，可在熒光顯微鏡下計數或使用流式細胞儀進行定量。信號強度比正常細胞高28倍，比壞死細胞高10倍。
（2）特點：1.可測定早期凋亡細胞；2.可測定DNA發生斷裂的時相； 3.地高辛/抗地高辛標記系統特異性好；4、適用于石蠟組織切片、冰凍組織切片，培養或分離的細胞的凋亡測定。
（3）設備：熒光顯微鏡/流式細胞儀，離心機，染色缸，水浴。
（4）步驟：將5x106 細胞加入1%副甲醛，固定15 min，離心，加70%乙醇，-20°C保存，洗滌，加TdT 2滴和50 ul 反應液。離心，洗滌，加100 ul熒光素標記的地高辛抗體，加1 ml碘化丙啶 （PI），染色15 min，流式細胞儀測定。熒光素標記的地高辛抗體可產生 523nm的發射光（綠色熒光），代表凋亡細胞；在620 nm處PI產生紅色熒光，代表其余全部細胞數目。
四、免疫組織化學方法：
1、原理：染色體裂解成核小體DNA，并與組蛋白H2A、H2B、H3、H4 緊密結合，保護DNA。用抗組蛋白和抗DAN的抗體ELISA法，提高靈敏度并能測定早期凋亡細胞。
2、方法：抗組蛋白抗體包被酶標板，加入含有核小體的待測細胞裂解液，加入抗DNA 抗體-POD（可與核小體中的DNA結合），加底物DAB，酶標儀測定。
3、設備：試劑盒（Boehringer Mannheim），酶標儀，酶標板。