細胞外囊泡（細胞微粒、外泌體）檢測（二）

（2）ZL的折射率校正功能

利用流式細胞儀進行細胞外囊泡檢測往往需要使用標準微球（microspheres）來校正和設門（Set Gate），常用的微球材料有聚苯乙烯（Polystyrene）和二氧化硅（silica），國際血栓與止血協會和標準化委員會（ISTH SSC）推薦用于循環微粒（微囊泡）檢測設門的Megamix就是聚苯乙烯微球。但是，最近越來越多的研究人員發現，用標準微球進行設門存在很嚴重的偏差，因為不同材料的微球的折射率（refractive index）是不一樣的，相同直徑的微球，折射率越大產生的散射光就越強。而且微球的折射率要遠遠大于生物囊泡的折射率，意味著微球產生的散射光強度是相同直徑囊泡的幾十倍。實際上，0.5mm聚苯乙烯微球（Megamix）產生的散射光強度相當于1.4mm的囊泡，而2.7mm的囊泡才能產生跟0.9mm聚苯乙烯微球（Megamix） 相當強度的散射光（表1）[2]。因此，如果我們用0.5mm的聚苯乙烯微球（Megamix）設門來檢測小于0.5mm的細胞外囊泡將產生嚴重的偏差，檢測結果也是不可信的。

*FSRI, forward scatter relative intensity measured on the Apogee A40. **Diameter of a lipid or cellular microparticle with the same forward scatter relative intensity as the particle that was measured. Equivalent microparticle diameter (mm) = 3.2911(PD) - 0.2768, where PD = polystyrene microsphere diameter (mm).

為了解決這一問題，Apogee的工程師們研發了ZL的折射率校正功能，無論是單參數的柱狀圖（Histogram）還是雙參數的散點圖（Cytogram），只要單擊右鍵選擇“Choose Calibration Scale”就會出現一條校正大小的標尺，并且可以根據檢測樣本的折射率來選擇相應折射率的標尺（圖2），那么我們就可以根據樣本的直徑大小和折射率這兩個參數來設門和選擇我們感興趣的區域（region of interest, ROI），得到真實可靠的結果。

圖2.折射率分別為1.38和1.42的微粒（180, 240,300 ,590, 880, 1300, 2000nm）在散點圖中的位置。

（3）不依賴于抗體微珠的外泌體檢測能力

由于外泌體（exosomes）的直徑特別小（40 - 100nm），超出了傳統流式細胞儀的檢測范圍，為此，很多公司提供了特異抗體標記的微珠用于外泌體的富集和流式分析，但這種方法的局限是操作復雜，對抗體特異性要求很高，而且無法知道外泌體的絕對數量。而Apogee A50-Micro超高的靈敏度和分辨率使其可以直接對樣本中的外泌體進行分析和計數，操作簡單，結果準確，美國個性化醫療的領軍生物技術公司Caris Life Sciences正是利用A50-Micro來檢測和分析復雜病人樣本中的微囊泡和外泌體[3]。一流企業的選擇，值得您的信賴！

[1] Lacroix R, Robert S, Poncelet P, Dignat-George F. Overcoming limitations of microparticle measurement by flow cytometry. Semin Thromb Hemost. 2010 Nov;36(8):807-18.
[2] Chandler WL, Yeung W, Tait JF. A new microparticle size calibration standard for use in measuring smaller microparticles using a new flow cytometer. J Thromb Haemost. 2011 Jun;9(6):1216-24.
[3] Abstracts from the Third International Meeting of ISEV 2014. Rotterdam, The Netherlands, April 30th – May 3rd, 2014. J Extracell Vesicles. 2014; 3:24214.