細胞如何檢測是否支原體污染？

我的細胞，居然背著我養“小三”！

那“小三”，名叫  支 · 原 · 體 !!!

因為這“小三”，我的細胞表現都變了！
瞞我這么久，原來這些日子都是假的！

就讓BI帶您來了解這位不速之客吧！

全球實驗室狀況支原體流行中

▲ 全球平均有約15~35%細胞實驗室發生支原體污染（65~80%嚴重污染），超過一半實驗室有兩種支原體污染；而全球各地的細胞庫中，也有發現5~35%不等的支原體感染率，日本甚至高達60%。

但！全球目前有在做常規支原體監控的細胞實驗室卻不到50%！ 

支原體知己知彼

支原體為細菌的一類，最早在1898年由法國 E. Nocard 及 E.R.Roux 從肺疫牛隻中分離出來，1956年才正式命名為支原體 (Mycoplasma)；支原體大小介于細菌與病毒之間 (直徑介于0.15-0.3μm)，為目前發現最小最簡單的原核微生物，唯一可見的胞器是核糖體，沒有細胞壁，只有三層結構的細胞膜 (下圖1)，所以呈高度多形性，有球形、桿形、絲狀，分枝狀等多種態 (下圖2)。

▲ 圖1：支原體結構圖

▲圖2：支原體的各種形態

大多支原體基因組只有0.58－1.38百萬堿基，這使得它的生物合成能力薄弱，必須利用本身細胞膜表面高密度的黏附素附著于宿主細胞表面，并交換宿主的細胞質及細胞膜成分，來獲取增殖需要的物質。但由于支原體生長條件復雜，使得菌體培養困難重重，導致過去支原體一直不受關注；近幾年，拜分子生物學與基因組學的進步所賜，基因構造簡單的支原體已引起了較為廣大注意。

敵人清單實驗室污染種類

至今，共有超過180種支原體被發現，有超過20種能感染體外培養的細胞，而目前實驗室最常見(95% 以上)的支原體則來自其中6種：

• 源自于實驗人員鼻腔、口腔，并經由飛沫傳至培養細胞中的口腔支原體（M.orale）、豬鼻支原體（M.fermentans）及人型支原體（M.hominis），居于首位（占總體的50%以上）。

• 其次則為大多來自牛血清的精氨酸支原體（M. Arginini）、萊氏無膽甾支原體（A. Laidlawii）、及來自豬源胰酶的豬鼻支原體（M. Hyorhinis）。
  

• PS：BI胰酶經過輻照，不含活的支原體。

• 可惡的東西支原體“麻煩精”

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  既然支原體是細菌的一種，抗生素一加不就好了嗎?  
  為什么可以搞到全球這么多細胞庫污染?

  你說，支原體煩不煩！
  怎知有“小三”？檢測檢測再檢測

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  目前檢測方法可大致分成四種：
  ■微生物培養法
  將樣品培養在特殊瓊脂培養基上，在37oC有氧環境中孵育2周，陽性培養基上會長出100~400um大小的“煎蛋狀”菌落。
  ■DNA螢光染色法
  支原體DNA中A-T含量占多數（55～80%），容易被Hoechst 33258此熒光劑染上，被支原體污染之細胞經染色后，在細胞核外與細胞周圍可看到許多大小均一之螢光小點。
  ■ELISA法
  將支原體16S核糖體RNA標上標簽，然后用特定抗體預包被過的微孔板對標簽進行捕獲，再加入顯色用的抗體及底物，最后通過比色法得出檢測結果。
  ■PCR法
  原理為擴增支原體16S核糖體RNA的基因，能檢測多達19種支原體，操作快速、準確性高，市面上有多款相關產品可參考 (BI：EZ-PCR支原體檢測試劑盒)。
   

  看我妙招
  怎么消滅“小三”

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  消滅支原體依不同處理發法，分成四大類：
  ■物理法：高溫高壓滅菌
  ■免疫法：使用支原體特異性抗血清、裸鼠傳代法
  ■化學法：界面活性劑處理（BI：Pharmacidal 支原體噴壺）
  ■生化法：使用抗生素等藥物（BI：BIOMYC 支原體處理試劑）

  　目前，大環內酯（Macrolides）、四環素（Tetracyclines）和喹諾酮（Quinolones）這三類抗生素，是公認對抗支原體效果最佳的藥物，而市面上有許多針對不同菌株配置的抗生素產品可以參考。

  如果你的細胞檢測結果為～

  　　＂無支原體污染＂

  那恭喜你啦！要好好維持！
   

  要怎么預防支原體污染?

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  培養良好的無菌操作實驗習慣
  感冒咳嗽時盡量不要使用細胞房，如果必須使用，請在實驗后徹底清潔消毒使用空間。

  新購產品檢測
  新購買血清等動物源產品、細胞株等，在使用前先做支原體檢測；或從有資質的正規廠商購買相關產品。（上海逍鵬生物-以色列BI細胞培養試劑）

  常規工作要落實
  定期檢測使用中的細胞，定期擦拭、清潔實驗室環境（BI：Pharmacidal 支原體噴壺）。

  最小化抗生素使用頻率
  非珍貴細胞污染，請直接丟棄，避免抗生素濫用導致抗藥性產生

• 支原體體積非常小, 極易通過0.22um濾膜, 且一般光學顯微鏡無法觀察到。                                      

• 支原體能附著并存活在器物表面(操作臺, 培養箱,顯微鏡等), 提高操作污染概率。                              

• 支原體生長緩慢，通常不破壞宿主細胞但默默改變了細胞生長代謝，且對傳統抗生素具抗性，因為抗生素大多破壞細菌細胞壁, 而支原體恰恰沒有細胞壁。                                   

• 支原體污染初期, 培養基不變色, 細胞形態正常，但等大量污染時, 為時已晚, 耗時又耗力。

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參考資料
Sugandha,G. Mycoplasma: Morphology, Cell Shape and Reproduction.

Nikfarjam Laleh, Farzaneh Parvaneh. Preventionand Detection of Mycoplasma Contamination in Cell Culture. Cell J. 2012.