細胞核與線粒體的分級分離

實驗概要

通過細胞勻漿和離心的方法分級分離細胞的組分，以了解其原理及過程。

實驗原理

細胞內不同結構的比重和大小都不相同，在同一離心場內的沉降速度也不相同，根據這一原理，常用不同轉速的離心法，將細胞內各種組分分級分離出來。

分離細胞器最常用的方法是將組織制成勻漿，在均勻的懸浮介質中用差速離心法進行分離，其過程包括組織細胞勻漿、分級分離和分析三步，這種方法已成為研究亞細胞成分的化學組成、理化特性及其功能的主要手段。

勻漿(Homogenization)低溫條件下，將組織放在勻漿器中，加入等滲勻漿介質(即0.25mol／L 蔗糖一0.003mol／L 氯化鈣)進行破碎細胞使之成為各種細胞器及其包含物的勻漿。

分級分離(Fractionation)由低速到高速離心逐漸沉降。先用低速使較大的顆粒沉淀，再用較高的轉速，將浮在上清液中的顆粒沉淀下來，從而使各種細胞結構，如細胞核、線粒體等得以分離。由于樣品中各種大小和密度不同的顆粒在離心開始時均勻分布在整個離心管中，所以每級離心得到的第一次沈淀必然不是純的最重的顆粒，須經反復懸浮和離心加以純化。分析分級分離得到的組分，可用細胞化學和生化方法進行形態和功能鑒定。

主要試劑

1. 0.25mol／L 蔗糖一0.003mol／L 氯化鈣溶液

2. 1％甲苯胺蘭染液

3. 0.02％詹納斯綠B 染液

4. 0.9％NaCl 溶液

主要設備

1. 玻璃勻漿器

2. 普通離心機

3. 臺式高速離心機

4. 普通天平

5. 光學顯微鏡

6. 載玻片、蓋玻片

7. 刻度離心管

8. 高速離心管

9. 滴管

10. 10ml 量筒

11. 25ml 燒杯

12. 玻璃漏斗

13. 解剖剪

14. 鑷子

15. 吸水紙、紗布

16. 螬盤、平皿、牙簽等

實驗材料

小白鼠、冰塊

實驗步驟

1. 細胞核的分離提取

   1) 用頸椎脫位的方法處死小白鼠后，迅速剖開腹部取出肝臟，剪成小塊(去除結締組織)盡快置于盛有0.9％NaCl 的燒杯中，反復洗滌，盡量除去血污，用濾紙吸去表面的液體。

   2) 將濕重約1g 的肝組織放在小平皿中，用量筒量取8ml 預冷的0.25mol／L 蔗糖一0.003mol／L 氯化鈣溶液，先加少量該溶液于平皿中，盡量剪碎肝組織后，再全部加入。

   3) 剪碎的肝組織倒入勻漿管中，使勻漿器下端浸入盛有冰塊的器皿中，左手持之，右手將勻漿搗桿垂直插入管中，上下轉動研磨3～5 次，用3 層紗布過濾勻漿液于離心管中，然后制備一張涂片①，做好標記，自然干燥。

   4) 將裝有濾液的離心管配平后，放入普通離心機，以2500rpm，離心15 分鐘；緩緩取上清液，移入高速離心管中，保存于有冰塊的燒杯中，待分離線粒體用；同時涂一張上清液片②做好標記，自然干燥；余下的沉淀物進行下一步驟。

   5) 用6ml0.25mol/L 蔗糖一0.003mol／L 氯化鈣溶液懸浮沉淀物，以2500rpm 離心15分鐘棄上清，將殘留液體用吸管吹打成懸液，滴一滴于干凈的載玻片上，涂片③，自然干燥。

   6) 將①、②、③涂片用l％甲苯胺蘭染色后蓋片即可觀察。

2. 高速離心分離提取線粒體

   1) 將裝有上清液的高速離心管，從裝有冰塊的燒杯中取出，配平后，以17000rpm 離心20 分鐘，棄上清，留取沉淀物。

    2) 加入0．25mol／L 蔗糖一0．003mol／L 氯化鈣液lml，用吸管吹打成懸液，以17000rpm離心20  分鐘，將上清吸入另一試管中，留取沉淀物，加入0.1ml 0．25mol／L 蔗糖一0.003mol／L 氯化鈣溶液混勻成懸液(可用牙簽)。

   3) 取上清液和沉淀物懸液，分別滴一滴于干凈載玻片上(分別標記④、⑤涂片)，各滴一滴0.02％詹納斯綠B 染液蓋上蓋片染20 分鐘。