細菌的鞭毛染色(Flagellastain)

實驗器材
1.活材料
培養12-16h的水稻黃單胞菌（Xanthomonas oryzae），粘質賽氏桿菌（Serratia marcescens）或假單細胞菌（Pseudomonas sp.）斜面菌種。
2.染色液和試劑
硝酸銀染色液、Leifson染色液、香柏油、二甲苯。
3.器材
載玻片、擦鏡紙、吸水紙、記號筆、玻片擱架、鑷子、接種環，顯微鏡。
四 實驗方法
1.鍍銀法染色
（1）清洗玻片 選擇光滑無裂痕的玻片，最好選用新的。為了避免玻片相互重疊，應將玻片插在專用金屬架上，然后將玻片置洗衣粉過濾液中（洗衣粉煮沸后用濾紙過濾，以除去粗顆粒），煮沸20min。取出稍冷后用自來水沖洗、晾干，再放入濃洗液中浸泡5—6天，使用前取出玻片，用自來水沖去殘酸，再用蒸餾水洗。將水瀝干后，放入95%乙醇中脫水。
（2）菌液的制備及制片：菌齡較老的細菌容易失落鞭毛，所以在染色前應將待染細菌在新配制的牛肉膏蛋白胨培養基斜面上（培養基表面濕潤，斜面基部含有冷凝水）連續移接3-5代，以增強細菌的運動力。最后一代菌種放恒溫箱中培養12—16h。然后，用接種環挑取斜面與冷凝水交接處的菌液數環，移至盛有1— 2mL無菌水的試管中，使菌液呈輕度混濁。將該試管放在37℃恒溫箱中靜置10min（放置時間不宜太長，否則鞭毛會脫落），讓幼齡菌的鞭毛松展開。然后，吸取少量菌液滴在潔凈玻片的一端，立即將玻片傾斜，使菌液緩慢地流向另一端，用吸水紙吸去多余的菌液。涂片放空氣中自然干燥。

用于鞭毛染色的菌體也可用半固體培養基培養。方法是將0.3-0.4%的瓊脂肉膏培養基熔化后倒入無菌平皿中，待凝固后在平板中央點接活化了3-4代的細菌，恒溫培養12-16h后，取擴散菌落的邊緣制作涂片。
（3）染色
①滴加A液，染4—6min。
②用蒸餾水充分洗凈A液。
③用B液沖去殘水，再加B液于玻片上，在酒精燈火焰上加熱至冒氣，約維持0.5—1min（加熱時應隨時補充蒸發掉的染料，不可使玻片出現干涸區）。
④用蒸餾水洗，自然干燥。
（4）鏡檢：先低倍，再高倍，最后用油鏡檢查。
結果：菌體呈深褐色，鞭毛呈淺褐色。
2.改良Leifson染色法
（1）清洗玻片法同1。
（2）配制染料 染料配好后要過濾15-20次后染色效果才好。
（3）菌液的制備及涂片
①菌液的制備同1。
②用記號筆在潔凈的玻片上劃分3—4個相等的區域。
③放1滴菌液于第一個小區的一端，將玻片傾斜，讓菌液流向另一端，并用濾紙吸去多余的菌液。
④干燥 在空氣中自然干燥。
（4）染色
①加染色液于第一區，使染料覆蓋涂片。隔數分鐘后再將染料加入第二區，依此類推（相隔時間可自行決定），其目的是確定最合適的染色時間，而且節約材料。
②水洗：在沒有傾去染料的情況下，就用蒸餾水輕輕地沖去染料，否則會增加背景的沉淀。
③干燥：自然干燥。
（5）鏡檢 先低倍觀察，再高倍觀察，最后再用油鏡觀察，觀察時要多找一些視野，不要企圖在1-2個視野中就能看到細菌的鞭毛。
結果：菌體和鞭毛均染成紅色。

五 注意事項
1.鍍銀法染色比較容易掌握，但染色液必須每次現配現用，不能存放，比較麻煩。
2.Leifson染色法受菌種、菌齡和室溫等因素的影響，且染色液須經15-20次過濾，要掌握好染色條件必須經過一些摸索。
3.細菌鞭毛極細，很易脫落，在整個操作過程中，必須仔細小心，以防鞭毛脫落。
4.染色用玻片干凈無油污是鞭毛染色成功的先決條件。