綜述：細胞凋亡（二）

細胞凋亡的過程及機理
　　細胞凋亡的過程大致可分為以下幾個階段：
接受凋亡信號→凋亡調控分子間的相互作用→蛋白水解酶的活化（Caspase）→進入連續反應過程
　　1．凋亡的啟動階段
細胞凋亡的啟動是細胞在感受到相應的信號刺激后胞內一系列控制開關的開啟或關閉，不同的外界因素啟動凋亡的方式不同，所引起的信號轉導也不相同，客觀上說對細胞凋亡過程中信號傳遞系統的認識還是不全面的，目前比較清楚的通路主要有： 
　　1）細胞凋亡的膜受體通路：各種外界因素是細胞凋亡的啟動劑，它們可以通過不同的信號傳遞系統傳遞凋亡信號，引起細胞凋亡，我們以Fas -FasL為例：
Fas是一種跨膜蛋白，屬于腫瘤壞死因子受體超家族成員，它與FasL結合可以啟動凋亡信號的轉導引起細胞凋亡。它的活化包括一系列步驟：首先配體誘導受體三聚體化，然后在細胞膜上形成凋亡誘導復合物，這個復合物中包括帶有死亡結構域的Fas相關蛋白FADD。 Fas又稱CD95，是由325個氨基酸組成的受體分子，Fas一旦和配體FasL結合，可通過Fas分子啟動致死性信號轉導，最終引起細胞一系列特征性變化，使細胞死亡。Fas作為一種普遍表達的受體分子，可出現于多種細胞表面，但FasL的表達卻有其特點，通常只出現于活化的T細胞和NK細胞，因而已被活化的殺傷性免疫細胞，往往能夠最有效地以凋亡途徑置靶細胞于死地。 Fas分子胞內段帶有特殊的死亡結構域（DD, death domain）。三聚化的Fas和FasL結合后，使三個Fas分子的死亡結構域相聚成簇，吸引了胞漿中另一種帶有相同死亡結構域的蛋白FADD。FADD是死亡信號轉錄中的一個連接蛋白，它由兩部分組成：C端（DD結構域）和N端（DED）部分。DD結構域負責和Fas分子胞內段上的DD結構域結合，該蛋白再以DED連接另一個帶有DED的后續成分，由此引起N段DED隨即與無活性的半胱氨酸蛋白酶8（caspase8）酶原發生同嗜性交聯，聚合多個caspase8的分子，caspase8分子逐由單鏈酶原轉成有活性的雙鏈蛋白，進而引起隨后的級聯反應，即Caspases，后者作為酶原而被激活，引起下面的級聯反應。細胞發生凋亡。因而TNF誘導的細胞凋亡途徑與此類似 
　　2）細胞色素C釋放和Caspases激活的生物化學途經
線粒體是細胞生命活動控制中心，它不僅是細胞呼吸鏈和氧化磷酸化的中心，而且是細胞凋亡調控中心。實驗表明了細胞色素C從線粒體釋放是細胞凋亡的關鍵步驟。釋放到細胞漿的細胞色素C在dATP存在的條件下能與凋亡相關因子1（Apaf-1）結合，使其形成多聚體，并促使caspase-9與其結合形成凋亡小體，caspase-9被激活，被激活的caspase-9能激活其它的caspase如caspase-3等，從而誘導細胞凋亡。此外，線粒體還釋放凋亡誘導因子，如AIF，參與激活caspase。可見，細胞凋亡小體的相關組份存在于正常細胞的不同部位。促凋亡因子能誘導細胞色素C釋放和凋亡小體的形成。很顯然，細胞色素C從線粒體釋放的調節是細胞凋亡分子機理研究的關鍵問題。多數凋亡刺激因子通過線粒體激活細胞凋亡途經。有人認為受體介導的凋亡途經也有細胞色素C從線粒體的釋放。如對Fas應答的細胞中，一類細胞（type1）中含有足夠的胱解酶8 （caspase8）可被死亡受體活化從而導致細胞凋亡。在這類細胞中高表達Bcl-2并不能抑制Fas誘導的細胞凋亡。在另一類細胞（type2）如肝細胞中，Fas受體介導的胱解酶8活化不能達到很高的水平。因此這類細胞中的凋亡信號需要借助凋亡的線粒體途經來放大，而Bid -- 一種僅含有BH3結構域的Bcl-2家族蛋白是將凋亡信號從胱解酶8向線粒體傳遞的信使。
　　2．凋亡的執行
盡管凋亡過程的詳細機制尚不完全清楚，但是已經確定Caspase即半胱天冬蛋白酶在凋亡過程中是起著必不可少的作用，細胞凋亡的過程實際上是Caspase不可逆有限水解底物的級聯放大反應過程，到目前為止，至少已有14種Caspase被發現，Caspase分子間的同源性很高，結構相似，都是半胱氨酸家族蛋白酶，根據功能可把Caspase基本分為二類：一類參與細胞的加工，如Pro-IL-1β和Pro-IL-1δ，形成有活性的IL-1β和IL-1δ；第二類參與細胞凋亡，包括caspase2,3,6,7,8,9.10。Caspase家族一般具有以下特征：
　　1）C端同源區存在半胱氨酸激活位點，此激活位點結構域為QACR/QG。
　　2）通常以酶原的形式存在，相對分子質量29000-49000（29-49KD），在受到激活后其內部保守的天冬氨酸殘基經水解形成大（P20）小（P10）兩個亞單位，并進而形成兩兩組成的有活性的四聚體，其中，每個P20/P10異二聚體可來源于同一前體分子也可來源于兩個不同的前體分子。
　　3）未端具有一個小的或大的原結構域。
參與誘導凋亡的Caspase分成兩大類： 啟動酶（inititaor）和效應酶（effector）它們分別在死亡信號轉導的上游和下游發揮作用。
Caspase活化機制：Caspase的活化是有順序的多步水解的過程，Caspase分子各異，但是它們活化的過程相似。首先在caspase前體的N-端前肽和大亞基之間的特定位點被水解去除N-端前肽，然后再在大小亞基之間切割釋放大小亞基，由大亞基和小亞基組成異源二聚體，再由兩個二聚體形成有活性的四聚體。去除N-端前肽是Caspase的活化的第一步，也是必須的，但是Caspase-9的活化不需要去除N-端前肽，Caspase活化基本有兩種機制，即同源活化和異源活化，這兩種活化方式密切相關，一般來說后者是前者的結果，發生同源活化的Caspase又被稱為啟動caspase（initiator caspase），包括caspase-8,-10,-9，誘導凋亡后，起始Caspase通過adaptor被募集到特定的起始活化復合體，形成同源二聚體構像改變，導致同源分子之間的酶切而自身活化，通常caspase-8, 10, 2介導死亡受體通路的細胞凋亡，分別被募集到Fas和TNFR1死亡受體復合物，而Caspase-9參與線粒體通路的細胞凋亡，則被募集到Cyt c/d ATP/Apaf-1組成的凋亡體（apoptosome）。同源活化是細胞凋亡過程中最早發生的capases水解活化事件，啟動Caspase活化后，即開啟細胞內的死亡程序，通過異源活化方式水解下游Caspase將凋亡信號放大，同時將死亡信號向下傳遞。異源活化（hetero-activation）即由一種caspase活化另一種caspase是凋亡蛋白酶的酶原被活化的經典途徑。被異源活化的Caspase又稱為執行caspase(executioner caspase)，包括Caspase-3,-6,-7。執行Caspase不象啟動Caspase ，不能被募集到或結合起始活化復合體，它們必須依賴啟動Caspase才能活化。

Caspase的效應機制
　　凋亡細胞的特征性表現，包括DNA裂解為200bp左右的片段，染色質濃縮，細胞膜活化，細胞皺縮，最后形成由細胞膜包裹的凋亡小體，然后，這些凋亡小體被其他細胞所吞噬，這一過程大約經歷30-60分鐘，Caspase引起上述細胞凋亡相關變化的全過程尚不完全清楚，但至少包括以下三種機制：
　　1．凋亡抑制物
正常活細胞因為核酸酶處于無活性狀態，而不出現DNA斷裂，這是由于核酸酶和抑制物結合在一起，如果抑制物被破壞，核酸酶即可激活，引起DNA片段化（fragmentation）。現知caspase可以裂解這種抑制物而激活核酸酶，因而把這種酶稱為Caspase激活的脫氧核糖核酸酶（caspase-activated deoxyribonulease CAD），而把它的抑制物稱為ICAD。因而，在正常情況下，CAD不顯示活性是因為CAD-ICAD，以一種無活性的復合物形式存在。ICAD一旦被Caspase水解，即賦予CAD以核酸酶活性，DNA片段化即產生，有意義的是CAD只在ICAD存在時才能合成并顯示活性，提示CAD-ICAD以一種其轉錄方式存在，因而ICAD對CAD的活化與抑制卻是必需要的。
　　2．破壞細胞結構 
Caspase可直接破壞細胞結構，如裂解核纖層，核纖層（Lamina）是由核纖層蛋白通過聚合作用而連成頭尾相接的多聚體，由此形成核膜的骨架結構，使染色質（chromatin）得以形成并進行正常的排列。在細胞發生凋亡時，核纖層蛋白作為底物被Caspase在一個近中部的固定部位所裂解，從而使核纖層蛋白崩解，導致細胞染色質的固縮。
　　3．調節蛋白喪失功能
Caspase可作用于幾種與細胞骨架調節有關的酶或蛋白，改變細胞結構。其中包括凝膠原蛋白（gelsin）、聚合粘附激酶（focal adhesion kinase ,FAK）、P21活化激酶α（PAKα）等。這些蛋白的裂解導致其活性下降。如Caspase可裂解凝膠原蛋白而產生片段，使之不能通過肌動蛋白（actin）纖維來調節細胞骨架。
除此之外，Caspase還能滅活或下調與DNA修復有關的酶、mRNA剪切蛋白和DNA交聯蛋白。由于DNA的作用，這些蛋白功能被抑制，使細胞的增殖與復制受阻并發生凋亡。
所有這些都表明Caspase以一種有條不紊的方式進行"破壞"，它們切斷細胞與周圍的聯系，拆散細胞骨架，阻斷細胞DNA復制和修復，干擾mRNA剪切，損傷DNA與核結構，誘導細胞表達可被其他的細胞吞噬的信號，并進一步使之降解為凋亡小體。

細胞凋亡的調節
　　細胞凋亡受到嚴格調控，在正常細胞Caspase處于非活化的酶原狀態，凋亡程序一旦開始，Caspase被活經隨后發生凋亡蛋白酶的層疊級聯反應，發生不可逆的凋亡。細胞是如何準確而又精確調節細胞凋亡呢？舉例如下：
　　1．凋亡抑制分子：
迄今為止，已發現多種凋亡抑制分子，包括P35，CrmA,IAPs，FLIPs以及Bcl-2家族的凋亡抑制分子。
　　1）P35和CrmA是廣譜凋亡抑制劑，體外研究結果表明P35以競爭性結合方式與靶分子形成穩定的具有空間位阻效應的復合體并且抑制Caspases活性，同時P35在位點DMQD！G被靶Caspases特異切割，切割后的P35與caspase的結合更強，CrmA（Cytokine response modfer A）是血清蛋白酶抑制劑，能夠直接抑制多種蛋白酶的活性，但目前還未發現在哺乳動物中發現P35和CrmA的同源分子。
　　2）FLIPs(FLICE-imhibirory proterins)能抑制Fas/TNFR1介導的細胞凋亡。它有多種變異體，但其N-端功能前區（Prodomain）完全相同，C端長短不一。FLIPs通過DED功能區，與FADD和Caspase-8，10結合，拮抗它們之間的相互作用，從而抑制Caspase8，10募集到死亡受體復合體和它們的起始化。
　　3）凋亡抑制蛋白（IAPs,inhibitors of Apoptosis protien）為一組具有抑制凋亡作用的蛋白質，首先是從桿狀病毒基因組克隆到，發現能夠抑制由病毒感染引起的宿主細胞死亡應答。其特性是有大約20氨基酸組成的功能區，這對IAPs抑制凋亡是必需要的，它們主要抑制Caspase3,-7，而不結合它的酶原，對Caspase則即可以結合活化的，又可結合酶原，進而抑制細胞凋亡。
　　2．Bcl-2家族：
這一家族有眾多成員，如Mcl-1、NR-B、A1 、Bcl-w、Bcl-x、Bax、Bak、Bad、Bim等，它們分別既有抗凋亡作用，也有促凋亡的作用。多數成員間有兩個結構同源區域，在介導成員之間的二聚體化過程中起重要作用。Bcl-2成員之間的二聚體化是成員之間功能實現或功能調節的重要形式。Bcl-2生理功能是阻遏細胞凋亡，延長細胞壽命，在一些白血病中Bcl-2呈過度表達。
Bcl-2的亞細胞定位已經明確，它在不同的細胞類型可以定位于線粒體、內質網以及核膜上，并通過阻止線粒體細胞色素C的釋放而發揮抗凋亡作用。此外， Bcl-2具有保護細胞的功能， Bcl-2的過度表達可引起細胞核谷胱苷肽（GSH）的積聚，導致核內氧化還原平衡的改變，從而降低了Caspase的活性。Bax是Bcl-2家族中參與細胞凋亡的一個成員，當誘導凋亡時，它從胞液遷移到線粒體和核膜。有人研究發現，細胞毒性藥物誘發凋亡時，核膜Bax水平的上升與lamin及PARP兩種核蛋白的降解呈正相關。用Bax寡核苷酸處理的細胞，只能特異地阻斷Lamin的降解，對PARP的降解不起作用。這種效應的調控機制目前仍然不清楚。
總之，細胞凋亡的調節是非常復雜的，參與的分子也非常多，還有很多不為我們所知的機理需要我們一步的探索。