編碼DNA結合蛋白的cDNA克隆的檢測、純化和鑒定實驗

含有多個串聯拷貝識別位點的、缺乏識別位點的（或含識別位點突變的）pUC重組質粒DNA

限制性內切核酸酶EcoRI及HhdIII 1 mol L Tris ? Cl pH 7. 5 5 mmol L dCTP dGTP dTTP dATP 5000 Ci mmol [α32P] dATP 大腸桿菌DNA聚合酶I Klenow片段

1) 用EcoRI和HindIII在100μL中消化20μg適當的pUC重組質粒DNA，釋放出含有2?10個蛋白質結合位點的插入片段。

2) 在限制酶切反應中加入下列成分：

1 mol/L Tris ? Cl, pH 7.5,終濃度 50 mmol/L 、dCTP、dGTP、dTTP 各 5 mmol/L,終濃度 100μLmol/L 、200μ Ci [α32P] dATP (5000Ci/mmol)、10 U Klenow 酶

室溫下溫育30 min。加入5 mmol/L dATP至100μmol/L繼續溫育30 min。

3) 加EDTA至20 mmol/L以中止反應。依次用25: 24 : 1的酚/氯仿/異戊醇及24 : 1 的氯仿/異戊醇抽提DNA。加乙酸鈉至0. 3 mol/L,用100%乙醇沉淀DNA。

4) 重懸于200μL水中，加22μL 3 mol/L乙酸鈉，pH 5.2，再用100%的乙醇沉淀。

5) 用0.75 mm厚、5%的非變性聚丙烯酰胺凝膠分離標記的DNA片段。

6) 用放射自顯影使標記的DNA片段顯跡。將含有結合位點片段的凝膠條切出，浸泡于1.5 mL洗脫緩沖液中于4℃振搖過夜。

7) 用移液器轉移上清，用Elutip-d層析柱從上清中純化標記的探針。用閃爍計數 (cpm)確定³²P標記的DNA結合位點探針的活性，并在4℃保存。

上述反應條件可產生具有2?4×10⁷cpm/pmol比活性的DNA探針。足以用于篩選20張呈現約10⁶個噬斑的濾膜。

8) 37℃在LB/麥芽糖/氨芐青霉素培養液中培養大腸桿菌Y1090至生長飽和（通常過夜)。

9) 每涂布一塊平板，在一個試管中將0.5 mL Y1090過夜培養物與λgtll文庫（含有 3×10⁴?5×10⁴pfu)混合。

10) 在37℃溫育15 min使噬菌體吸附到細胞上。

11) 加9 mL頂層瓊脂糖于每個試管中，顛倒混合幾次，鋪于含有LB/氨芐青霉素的150 mm平皿上。

12) 將平皿置于42℃溫育約3 h直至可見細小噬斑。

13) 將平皿移至37℃溫箱，不要讓平皿降至37℃以下。

14) 準備用于覆蓋的硝酸纖維素膜（用平頭鑷子操作），將膜在10 mmol/L 的IPTG溶液中浸30 min,在室溫下空氣中干燥60 min。

15) 用經IPTG浸潤并晾干的硝酸纖維素膜覆蓋于每個平皿上，37℃繼續溫育6 h。

16) 將平皿置于4℃冷卻10 min。用針扎孔標記每張膜的位置。揭下膜浸于BLOTTO中。室溫下孵育60min，并輕輕旋動。用Parafilm膜封好主平皿，保存于4℃。 '

17) 將所有的膜都浸于盛有結合緩沖液中（500 mL/10張膜）的碟子中，在室溫下振蕩溫育5 min用新鮮的結合緩沖液重復洗滌2次（在篩選前濾膜可在4℃保存24 h)。

18) 將超聲處理的小牛胸腺DNA在100℃加熱10 min變性，然后放在冰上速冷。加入結合緩沖液至濃度為5μg/mL (最終體積為25 mL/10張濾膜）。在此溶液中加入³²P 標記的DNA結合位點探針（來自步驟7)至1×1O⁶?2 ×10⁶cpm/mL,約 10-10mol/L將濾膜一塊塊地放到探針溶液中，室溫下輕輕振蕩60 min。

19) 分批洗膜，室溫下每10張膜用500 mL結合緩沖液洗4次（每次洗7. 5 min,共 30 min)

20) 吸干濾膜，用塑料膜包裹，用增感屏在-70℃對×射線膠片曝光12?24 h。

21) 將噬菌體平皿與放射自顯影片對比，分離與陽性信號對應的瓊脂糖塊，并再生噬菌體液。

真正的陽性信號呈光暈狀。可做多張不同曝光時間的自顯影片以排除那些不能重復的信號點。

22) 用0.2 mL Y1090菌培養物和3 mL頂層瓊脂糖對再生的噬菌體液（約5000 pfu/ 100mm平皿）鋪板，參見步驟8?11。

23) 用82mm濾膜制備硝酸纖維素膜復印品并進行二次篩選，見步驟12?20。

24) 按照步驟1?7標記缺少識別位點（或含有突變的識別位點）的pVC重組質粒 DNA,用本實驗標記的探針來二次篩選真正陽性的噬菌體液。

25) 純化噬斑，將陽性噬菌體覆蓋上1滴氯仿，置于4℃保存。

篩選策略成功的關鍵在于cDNA文庫的質量及所采用的位點識別探針。用隨機引物構建的重組cDNA文庫及識別多位點的探針是優選的材料。合成的探針在用于篩選 前應先與所要研究的蛋白質進行結合試驗。如果有可能，應選擇在一系列相 關位點中親和力最高的位點來構建多位點探針。

其他所需試劑：

500 mmol/L EDTA pH 8.0，25 : 24 : 1 (體積比）酚/氯仿/異戊醇，24: 1氯仿/異戊醇，3 mol/L 乙酸鈉 pH 5.2 100%乙醇，洗脫緩沖液，大腸桿菌Y1090，λgtll cDNA 文庫，含有0.2%麥芽糖及50 mg/mL氨芐青霉素的LB培養液，0. 7%頂層瓊脂糖 熔化后置47°C平衡，100和150 mm含有50μg/mL氨芐青霉素的LB培養平板 干燥并預熱至37℃)，10 mmol/L IPTG (用無菌水制備成1 mol/L儲液置于-20℃保存)，BLOTTO ，結合緩沖液，1 mg/mL經超聲處理（長約1 kb)的小牛胸腺DNA 氯仿