缺失定位———基因精細結構分析

實驗方法原理 
如果某一待測缺失突變株能和一種已知缺失突變株進行重組,表明這一待測突變的位置一定不在已知缺失區域內。如果不能重組,待測定菌株突變位置便在已知缺失范圍內。

菌株A、B、C的缺失區域是已知的,另外有一系列點突變菌株1、2、3和4。分別將它們兩兩滴加在固體培養基表面的同一位置上,根據是否出現野生型重組子(用+號表示),便可以知道點突變發生的位置。如果A、B、C三個菌株缺失的片段在下圖中虛線所表示的范圍,那么就可以知道這四個點突變的位置的順序是1432或1342。這里虛線兩端的實線表示的染色體實際上是連接著的

如果另外還有一個缺失菌株D,它的缺失范圍也是已知的(缺失位置如圖34-2所示),它與待測菌株3滴加在一起時出現野生型重組子,可是和待測菌株4滴加在一起時卻不出現野生型重組子,那么可以進一步證實突變位點的順序是1432而不是1342。由此可見,只要有足夠多的缺失菌株,就可以區別十分接近的突變位點。缺失定位不僅可以應用于一般基因定位的研究,而且還可以應用于一個基因的突變位點的定位,即基因的精細結構分析。

缺失定位不僅可以用選擇性培養方法提高效率,而且所需觀察的結果只是能或不能重組,無須觀察統計重組子的數量。因此這種基因定位方法不但效率高,而且比較準確。當然,應用這種方法事先需要獲得一套缺失突變菌株。

本實驗進行lacZ基因內精細結構的定位。采用一套已知在大腸桿菌染色體lacZ基因內發生了無義點突變的F-菌株和一套在F′上帶有lacpro染色體片段,并且在其中lacZ基因上發生了不同長度缺失的菌株。由于實驗所用的F-菌株為trp-strr,而帶F′的供體菌為strs,所以可在含乳糖的基本培養基中加入色氨酸和鏈霉素以選擇受體菌,并排除供體菌。應用滴加雜交技術在這種培養基上能很方便地觀察,分析出這兩套菌株lacZ基因中發生突變的位置或發生缺失的長度,即對點突變或缺失突變定位。
實驗材料 大腸桿菌
試劑、試劑盒 LB 液體培養基 乳糖色氨酸鏈霉素固體培養基 12 皿
儀器、耗材 高壓滅菌鍋 恒溫培養箱 培養皿 吸管
實驗步驟 
1.將供體菌和受體菌接于5mlLB培養液中,30℃培養振蕩過夜。

2.在30℃或37℃中放置過夜的比較干燥的含乳糖、色氨酸和鏈霉素的基本培養基上進行滴加雜交試驗,每組12皿。將每個平板按34-3圖分成9格,各標上12、13、14、…、19,第9格標上①或②、③、④、…、1及空白對照。12～19分別為供體菌CSH12、CSH13、……、CSH19,圈內的號碼為受體菌株編號。先將受體菌①滴加在平板①的9個區域中,在平板②中滴加受體菌②于9個區域中,直至平板1,空白對照平板不加受體菌。用接種環在每個平板上標有12的區域中滴加供體菌12。每個平板標記區域中均滴加供體菌株12后,再加供體菌株13,直至供體菌株19,空白對照平板不滴加受體菌株,只加供體菌株12～19。待平板表面滴加液干后,置于37℃培養24～48h。

3.觀察結果

注意事項 
1.滴加雜交的平板要適當干燥,這樣有利用于菌液快速吸干。

2.在滴加有受體菌的平板上再加供體菌,每加一處后接種環必須進行火焰滅菌,以免將一種菌液混入另一雜交區域。