實驗原理
考馬斯亮藍(Coomassie Brilliant Blue)法測定蛋白質濃度,是利用蛋白質―染料結合的原理,定量的測定微量蛋白濃度的快速、靈敏的方法。這種蛋白質測定法具有超過其他幾種方法的突出優點,因而正在得到廣泛的應用。這一方法是目前靈敏度最高的蛋白質測定法。
考馬斯亮蘭G-250染料,在酸性溶液中與蛋白質結合,使染料的最大吸收峰(lmax)的位置,由465nm變為 595nm,溶液的顏色也由棕黑色變為蘭色。通過測定595nm處光吸收的增加量可知與其結合蛋白質的量。研究發現,染料主要是與蛋白質中的堿性氨基酸(特別是精氨酸)和芳香族氨基酸殘基相結合。
考馬斯亮藍染色法的突出優點是:
(1)靈敏度高,據估計比Lowry法約高四倍,其最低蛋白質檢測量可達1mg。這是因為蛋白質與染料結合后產生的顏色變化很大,蛋白質-染料復合物有更高的消光系數,因而光吸收值隨蛋白質濃度的變化比Lowry法要大的多。
(2)測定快速、簡便,只需加一種試劑。完成一個樣品的測定,只需要5分鐘左右。由于染料與蛋白質結合的過程,大約只要2分鐘即可完成,其顏色可以在1小時內保持穩定,且在5分鐘至20分鐘之間,顏色的穩定性最好。因而完全不用像Lowry法那樣費時和嚴格地控制時間。
(3)干擾物質少。如干擾Lowry法的K+、Na+、Mg2+離子、Tris緩沖液、糖和蔗糖、甘油、巰基乙醇、EDTA等均不干擾此測定法。
此法的缺點是:
(1)由于各種蛋白質中的精氨酸和芳香族氨基酸的含量不同,因此考馬斯亮藍染色法用于不同蛋白質測定時有較大的偏差,在制作標準曲線時通常選用g—球蛋白為標準蛋白質,以減少這方面的偏差。
(2)仍有一些物質干擾此法的測定,主要的干擾物質有:去污劑、 Triton X-100、十二烷基硫酸鈉(SDS)等。