腫瘤早期診斷新靶標之ctDNA

　　腫瘤液態活檢是目前最具發展潛力的腫瘤無創診斷和實時療效監測手段，區別于傳統的臨床診斷手段，該方法具有簡便、安全、無創、實時等特點。廣義而言，腫瘤液態活檢主要是指以外周血液為主的體液標本中細胞及核酸的檢測。通常包括了循環腫瘤細胞（CTC）和游離的DNA（ctDNA）兩大類，是目前精準醫療的最前沿領域之一，臨床應用價值極其顯著，在腫瘤的診療領域具有良好的應用前景。

　　1.外周血游離DNA（Circulating tumor DNA, ctDNA）介紹

　　臨床上很大一部分被診斷為癌癥的患者可以僅依靠手術和輔助治療手段緩解病癥，但是經過一段時間的潛伏期后會有超過80%的癌癥患者死于腫瘤細胞的轉移和復發。原因在于經過初步的治療后由于腫瘤細胞的暫時性休眠，其可以在這種狀態下傳播到其他組織器官中，而在這個過程中，腫瘤細胞會發生一系列的表觀改變，如EMT過程，從而使其逃避免疫監測和對藥物發生耐藥，進而實現轉移。腫瘤細胞的逃逸無疑給臨床治療造成了很大的困擾，因此，很多醫生和臨床科研人員都希望有一種快捷、精確的技術方法能夠有效地克服該難題，而循環DNA無疑就是輔助治療的有效方法之一。血漿中游離循環腫瘤DNA(Circulating Tumor DNA, ctDNA)是由腫瘤細胞釋放到血漿中的單鏈或者雙鏈DNA，攜帶有與原發腫瘤組織相一致的分子遺傳學信息。

　　早在1947年Mandel和Metais就發現了循環核酸；隨后Leon等人的研究結果表明腫瘤患者外周血清DNA水平大大高于正常人，之后的研究者在腫瘤患者的血漿和血清中檢測到了癌基因突變，并且與原發腫瘤相一致。2013年《The New England Journal of Medicine, NEJM》研究結果發現：ctDNA檢測作為一種無創的檢測方法，能夠真實的反映實體瘤組織中的基因突變圖譜與頻率，是治療效果的評估及治療后臨床隨訪的重要監測指標。ctDNA來自腫瘤細胞凋亡或壞死后進入循環系統的DNA片段，其保留了較為完整的基因信息（如圖1）。因此，ctDNA是一種特征性的腫瘤生物標記物，并且還可以被定性、定量和追蹤。

　　一直以來，科研工作者都在積極尋找能夠更好地反映腫瘤情況的生物標志物。ctDNA作為一種新的腫瘤標志物，在對腫瘤的早期診斷、治療及預后檢測等方面發揮著重要的作用，尤其是對于一些不具有典型臨床癥狀、檢查無特異性和診斷困難的腫瘤，檢測ctDNA可避免復雜的、具有創傷性的活檢。

　　在臨床工作中，通過檢測它是否攜帶有腫瘤特異性的突變，或其它相關基因組的改變信息就可以判斷腫瘤類型，而不會出現假陽性等干擾現象。常用ctDNA的檢測分析方法包括定量PCR，微滴數字式PCR（Droplet Digital PCR, ddPCR），BEAMing（beads, emulsion, amplification, magnetics），以及NGS相關的標記擴增深度測序方法（Tagged-amplicon deep sequencing, TAm-seq），全基因組測序，全外顯子測序等。可以對ctDNA進行定性分析，檢測基因突變、缺失、插入、融合、重排和雜合性缺失（LOH）等；也可以對ctDNA濃度進行定量分析，定性和定量兩種方法均可以反映腫瘤的存在和嚴重程度。

　　2.外周血游離DNA（Circulating tumor DNA, ctDNA）臨床應用

　　腫瘤患者血液循環系統中含有隨著血液不斷流動的攜帶一定特征的來自腫瘤基因組的DNA片段。這些DNA片段主要來源于四個部分：1、壞死的腫瘤細胞釋放的DNA片段；2、凋亡的腫瘤細胞釋放的DNA片段；3、循環腫瘤細胞釋放的DNA片段；4、腫瘤細胞分泌的外排體包含的DNA片段。自人類首次發現ctDNA以來，對其的研究就從未中斷過。在1994年，研究人員首次鑒定了來源于腫瘤的含有癌癥標志性突變的DNA。加上ctDNA的無創性和易獲得性，在其中發現的腫瘤標志物，被認為可以用于腫瘤診斷的各個過程。

　　Bettegowda報道了一篇文章，稱ctDNA水平在早期和晚期腫瘤中存在差異。研究人員發現，在640例患者中，ctDNA可檢測超過75%的晚期胰腺癌、卵巢癌、結直腸癌、膀胱癌、胃癌、乳腺癌、黑色素瘤、肝癌，以及頭頸癌。此外，在206例轉移性結直腸癌患者中，源自KRAS基因突變的ctDNA具有87.2%的敏感性和99.2%的異質性。研究人員還發現，96%的表皮生長因子受體被抑制后復發的患者體內有ctDNA，這就表明在絲裂原活化蛋白激酶途徑中發生了單基因或多基因突變。《Science Translational Medicine》發表的一項多樣本的研究報告中顯示可以在大約40%至70%的癌癥中檢測到循環腫瘤DNA，包括腦瘤、前列腺癌，根據多項研究結果我們可以看出ctDNA在絕大多數腫瘤疾病中均有發生，對腫瘤的發生具有重要提示作用。

　　目前隨著二代測序技術NGS的不斷發展，對ctDNA的監測分析已越來越多地應用于各種腫瘤的檢測之中，諸如對非小細胞肺癌、乳腺癌和胰腺癌等。在過去十年中，對非小細胞肺癌的理解發生了重要的變化。現在醫生認為，針對NSCLC的個性化治療，應該是利用這些分子亞型匹配相對應的靶向療法。表皮生長因子（EGFR）突變和ALK易位被認為是NSCLC治療最有效的靶點。但是EGFR和ALK的突變數量是多種多樣的，并且我們檢測到的突變類型還在不斷地增加。因此，現代科學家們利用基于NGS的ctDNA技術，從患者血液中可以獲得ROS1，BRAF，KRAS，HER2，PIK3CA等相關基因的突變信息，從而根據基因突變情況選擇合適的基因藥物，有針對性的進行靶向治療。乳腺癌轉移確診后，患者生存率較低。但是現在可以利用含有腫瘤染色體異質性的ctDNA來對乳腺癌進行檢測。一項臨床研究通過NGS方法能夠覆蓋很多低信號的全基因組測序結果，并且發現ctDNA監測是高度精確的，其成功預示了93%的復發病人。因此，ctDNA能夠預測不良生存期。這些發現表明，我們可以利用ctDNA檢測腫瘤細胞轉移情況，開展有針對性的治療。在Eric A教授的關于胰腺癌的研究中，他們分析了26名患者腫瘤中的54個基因，其中90.3%的腫瘤突變都能夠在ctDNA中發現，其正確率為97.7%，靈敏度為92.3%，特異性為100%。同時，他們發現，ctDNA與腫瘤標記動態是具有相關性的。因此，可以在胰腺癌和膽道癌患者中，通過ctDNA測序的方法，來確定患者的腫瘤基因型，從而為患者提供精準的個體化治療。

　　綜上所述，ctDNA因其分布具有廣泛性，且與來源組織基因保持高度的一致性，已經在臨床上獲得了越來越多的重視，在早期患病評估、病程監測、治療反應以及預后判斷等方面均已開展相關的應用嘗試且獲得了較為滿意的結果。

　　3.展望

　　ctDNA作為一種新的腫瘤標志物，其在腫瘤的診斷、治療及預后檢測等方面逐漸發揮出重要的作用，尤其是對于一些不具有典型臨床癥狀、檢查無特異性和診斷困難的腫瘤可避免復雜的、具有創傷性的活檢。正如Forshew所說：循環腫瘤標志物的前景是巨大的，因為其代表了最前沿的無創檢測技術，具有高度敏感性和特異性，對臨床輔助診斷具有高度的可信性。隨著腫瘤分子生物學研究的進展，血漿游離循環腫瘤DNA檢測技術必將成為臨床腫瘤早期診斷、預后判斷、跟蹤隨訪等的一項重要的分子生物學檢測手段。

　　但是在目前ctDNA依然存在著一些需要克服的難題。由于巨噬細胞的清除作用，通常體液中游離核酸（cfDNA）會被實時清除而導致含量極低，并且會被進入循環系統的健康DNA所掩蓋，從而難以檢出。不同腫瘤的敏感度差異大。具文獻報道，在640位14種腫瘤患者中只有不到50%的髓母細胞瘤、甲狀腺癌，以及不到10%的膠質瘤患者可以檢測到ctDNA。還有，目前ctDNA尚處于小范圍內測試，而且臨床檢測費用昂貴，導致很多病患負擔不起，這也是制約該項技術大規模推廣的原因之一。其次，ctDNA技術屬于新興的無創檢測技術，尚需不斷地優化完善，并沒有標準化。與其他高通量測序技術的臨床轉化一樣，ctDNA的臨床診斷和治療在大規模推廣前需要對其進行標準化。