腫瘤細胞原代培養實驗

瘤組織

Hanks液

平皿 培養瓶 恒溫箱

一、將取得的瘤組織去除脂肪、結締組織及壞死部分。

二、在平皿中用Hanks液洗3次，剪碎組織，切成1-2 mm³ 小塊。

三、接種于培養瓶（或皿）中，37℃、5%CO₂ 或加蓋并塞在普通恒溫箱中培養。

一、注意污染

1、嚴格進行動物皮膚消毒，使用三套器械取材。新生動物皮膚先用2%碘酒液消毒，成年鼠先用3%——5%碘酒液消毒后用75%酒精消毒。

2、嚴格進行無菌操作，防止細菌、霉菌、支原體污染，避免化學物質污染。自取材開始，保持所有組織細胞處于無菌條件。細胞計數可在有菌環境中進行。

3、吸取液體前，瓶口和吸管進行火焰消毒；吸取液體時，避免瓶口和吸管碰撞。

4、離心管入臺前，管口、管壁應消毒。

5、實驗者離開超凈臺時，要隨時用肘部關閉工作窗。

6、使用過的器械用酒精棉球擦去血污后，移入另一個器皿中繼續消毒，在浸泡器械時剪刀口要叉開放，鑷子彎頭要向下放，并加蓋消毒。凡在超凈臺外操作的步驟，各器皿需用蓋子或橡皮塞，以防止細菌落入。

二、器材使用時既要注意用火焰消毒，又要防止燙傷、燙死細胞。經火焰消毒后的吸管一定要用Hanks液冷卻。

一、對腫瘤細胞系或細胞株的評價
 

已建成的各種腫瘤細胞系或細胞株，無疑都是可用的實驗對象。近年我國已建成的腫瘤細胞系已非常多，并獲得越來越廣泛的應用。但根據研究者的經驗，在使用這些細胞系時，應持特別審慎態度，主要是應考慮到這些細胞在長期傳代中有否發生遺傳性改變的可能。眾所周知，長期傳代細胞系染色體核型常是不穩定的。另外也可能發生如基因突變、基因易位或缺失等變化。其結果可能導致細胞產生生物學性狀上的變動。
 

以近年建成的各種腫瘤細胞系為例，都已傳代少則幾十，多則百代以上后，才確認建成了細胞系。這種情況下很難保證細胞從初代到建成時的性狀仍是一致的。已如前述，癌細胞在培養中并非能很順利地傳下去，凡已長期傳代的細胞系，都已獲得不死性。當前尚未完全確證所有癌細胞都具有不死性；因此尚難肯定在長期培養中的癌細胞的生物學性狀與體內時仍完全相同（包括不死性）。據上述對用癌細胞系所獲實驗結果應盡量做分析性的結論，避免做概括性的與體內等同的結論，外推與體內等同更是不妥的。廣泛來說，應用各種較長時間培養細胞做實驗時，都應如此。

二、提高腫瘤細胞培養存活率和生長率措施
 

根據人們的經驗，腫瘤細胞在體外不易培養，建立能傳代的腫瘤細胞系更為困難。當腫瘤組織或細胞初代接種培養后，常出現以下幾種情況：
 

1.  完全無細胞游出或移動；
 

2.  有細胞移動和游出，但無細胞增殖，細胞長時間處于停滯狀態以致難以傳代；
 

3.  有細胞增殖，傳若干代后停止生長或衰退死亡；
 

4.  傳數代后細胞增殖緩慢，經過一段停滯期后，才又呈旺盛生長狀態，形成穩定生長的腫瘤傳代細胞系。
 

以上現象說明腫瘤細胞對體外生存條件有較高的要求，并需經過對新環境的適應才能生長，因此欲獲得好的培養效果，不能局限于一般培養法，必須采用一些特殊的措施。
 

1.  適宜底物
 

把經過純化的細胞接種在不同的底物上，如鼠尾膠原底層、飼細胞層等。
 

2.  生長因子
 

應用促細胞生長因子，向培養液中增加一種或幾種促細胞生長因子。根據細胞種類不同選用不同的促生長物，常用有胰島素、氫化可的松、雌激素以及其它生長因子。
 

為提高腫瘤細胞對體外培養環境的適應力和增加有活力癌細胞（干細胞）的數量，可采用動物體轉嫁接種成瘤后，再從動物體內取出進行培養，能提高體外培養的成功率。受體動物以裸鼠最好。
 

3、動物體媒介培養方法
 

（1）瘤塊接種：取新鮮瘤組織，用 Hanks液洗凈血污，切成 1～3毫米小塊，用穿刺針頭吸一小瘤塊，用酒精棉球擦拭動物腹部后，直接刺入皮下，注入瘤塊。
 

（2）飼養觀察，待腫瘤生長達較大體積后，剝取出瘤組織。
 

（3）進行體外培養。
 

（4）為防止失敗，仍取部分瘤組織繼續在裸鼠體內傳代。通過裸鼠媒介接種，有活力的腫瘤細胞數量增多，細胞培養易于成功。