腫瘤細胞原代培養實驗

　　實驗方法原理

　　腫瘤細胞的原代培養與正常細胞的原代培養的條件基本相似。一般常用原代細胞的基礎培養基，10%血清濃度即可，在原代培養時需加入原代細胞培養的特制添加物，或原患者血清（1%-2%）以利細胞生長。用細胞生長因子如胰島素、氫化可的松、雌激素等等。也可以考慮動物媒介培養。根據細胞種類不同選用不同的促細胞生長因子。

　　實驗材料

　　瘤組織

　　試劑、試劑盒

　　Hanks液

　　儀器、耗材

　　平皿 培養瓶 恒溫箱

　　實驗步驟

　　一、將取得的瘤組織去除脂肪、結締組織及壞死部分。

　　二、在平皿中用Hanks液洗3次，剪碎組織，切成1-2 mm3 小塊。

　　三、接種于培養瓶（或皿）中，37℃、5%CO2 或加蓋并塞在普通恒溫箱中培養。

　　注意事項

　　一、注意污染

　　1、嚴格進行動物皮膚消毒，使用三套器械取材。新生動物皮膚先用2%碘酒液消毒，成年鼠先用3%——5%碘酒液消毒后用75%酒精消毒。

　　2、嚴格進行無菌操作，防止細菌、霉菌、支原體污染，避免化學物質污染。自取材開始，保持所有組織細胞處于無菌條件。細胞計數可在有菌環境中進行。

　　3、吸取液體前，瓶口和吸管進行火焰消毒；吸取液體時，避免瓶口和吸管碰撞。

　　4、離心管入臺前，管口、管壁應消毒。

　　5、實驗者離開超凈臺時，要隨時用肘部關閉工作窗。

　　6、使用過的器械用酒精棉球擦去血污后，移入另一個器皿中繼續消毒，在浸泡器械時剪刀口要叉開放，鑷子彎頭要向下放，并加蓋消毒。凡在超凈臺外操作的步驟，各器皿需用蓋子或橡皮塞，以防止細菌落入。

　　二、器材使用時既要注意用火焰消毒，又要防止燙傷、燙死細胞。經火焰消毒后的吸管一定要用Hanks液冷卻。

　　其他

　　一、對腫瘤細胞系或細胞株的評價

　　已建成的各種腫瘤細胞系或細胞株，無疑都是可用的實驗對象。近年我國已建成的腫瘤細胞系已非常多，并獲得越來越廣泛的應用。但根據研究者的經驗，在使用這些細胞系時，應持特別審慎態度，主要是應考慮到這些細胞在長期傳代中有否發生遺傳性改變的可能。眾所周知，長期傳代細胞系染色體核型常是不穩定的。另外也可能發生如基因突變、基因易位或缺失等變化。其結果可能導致細胞產生生物學性狀上的變動。

　　以近年建成的各種腫瘤細胞系為例，都已傳代少則幾十，多則百代以上后，才確認建成了細胞系。這種情況下很難保證細胞從初代到建成時的性狀仍是一致的。已如前述，癌細胞在培養中并非能很順利地傳下去，凡已長期傳代的細胞系，都已獲得不死性。當前尚未完全確證所有癌細胞都具有不死性；因此尚難肯定在長期培養中的癌細胞的生物學性狀與體內時仍完全相同（包括不死性）。據上述對用癌細胞系所獲實驗結果應盡量做分析性的結論，避免做概括性的與體內等同的結論，外推與體內等同更是不妥的。廣泛來說，應用各種較長時間培養細胞做實驗時，都應如此。

　　二、提高腫瘤細胞培養存活率和生長率措施

　　根據人們的經驗，腫瘤細胞在體外不易培養，建立能傳代的腫瘤細胞系更為困難。當腫瘤組織或細胞初代接種培養后，常出現以下幾種情況：

　　完全無細胞游出或移動；

　　有細胞移動和游出，但無細胞增殖，細胞長時間處于停滯狀態以致難以傳代；

　　有細胞增殖，傳若干代后停止生長或衰退死亡；

　　傳數代后細胞增殖緩慢，經過一段停滯期后，才又呈旺盛生長狀態，形成穩定生長的腫瘤傳代細胞系。

　　以上現象說明腫瘤細胞對體外生存條件有較高的要求，并需經過對新環境的適應才能生長，因此欲獲得好的培養效果，不能局限于一般培養法，必須采用一些特殊的措施。

　　適宜底物

　　把經過純化的細胞接種在不同的底物上，如鼠尾膠原底層、飼細胞層等。

　　生長因子

　　應用促細胞生長因子，向培養液中增加一種或幾種促細胞生長因子。根據細胞種類不同選用不同的促生長物，常用有胰島素、氫化可的松、雌激素以及其它生長因子。

　　為提高腫瘤細胞對體外培養環境的適應力和增加有活力癌細胞（干細胞）的數量，可采用動物體轉嫁接種成瘤后，再從動物體內取出進行培養，能提高體外培養的成功率。受體動物以裸鼠最好。

　　3、動物體媒介培養方法

　　（1）瘤塊接種：取新鮮瘤組織，用 Hanks液洗凈血污，切成 1～3毫米小塊，用穿刺針頭吸一小瘤塊，用酒精棉球擦拭動物腹部后，直接刺入皮下，注入瘤塊。

　　（2）飼養觀察，待腫瘤生長達較大體積后，剝取出瘤組織。

　　（3）進行體外培養。

　　（4）為防止失敗，仍取部分瘤組織繼續在裸鼠體內傳代。通過裸鼠媒介接種，有活力的腫瘤細胞數量增多，細胞培養易于成功。

　　酶消化法

　　實驗方法原理

　　本法是利用成纖維細胞對膠原酶較為敏感的特點，通過消化進行選擇。可用0.5mg/ml的膠原酶消化處理，邊消化邊在倒置顯微鏡下窺視，當發現成纖維細胞被除掉后，即終止消化；用Hanks洗滌處理一次后，更換新培養液，繼續培養，可獲純凈腫瘤細胞。如成纖維細胞未被除凈，可再次重復。

　　實驗材料

　　組織

　　試劑、試劑盒

　　胰蛋白酶 膠原酶 小牛血清 完全培養基 RPMI-1640培養基

　　儀器、耗材

　　水浴鍋 培養瓶 培養箱

　　實驗步驟

　　一、剪碎組織，切成1-2 mm3 小塊中，加入0.25%胰蛋白酶或2 000 U/ml膠原酶。

　　二、在37℃水浴中消化30min或更長一些，去除消化液，用洗液洗3次，培養基洗1次后，用完全培養基懸浮，并用吸管吹打分散制成細胞懸液，計數。

　　三、以（5-10）x108 個/L細胞濃度，在含有10%小牛血清的RPMI、EagleMEM或DMEM中，在37℃、5%CO2 下分瓶（或皿）中培養。

　　注意事項

　　一、注意污染

　　1、嚴格進行動物皮膚消毒，使用三套器械取材。新生動物皮膚先用2%碘酒液消毒，成年鼠先用3%——5%碘酒液消毒后用75%酒精消毒。

　　2、嚴格進行無菌操作，防止細菌、霉菌、支原體污染，避免化學物質污染。自取材開始，保持所有組織細胞處于無菌條件。細胞計數可在有菌環境中進行。

　　3、吸取液體前，瓶口和吸管進行火焰消毒；吸取液體時，避免瓶口和吸管碰撞。

　　4、離心管入臺前，管口、管壁應消毒。

　　5、實驗者離開超凈臺時，要隨時用肘部關閉工作窗。

　　6、使用過的器械用酒精棉球擦去血污后，移入另一個器皿中繼續消毒，在浸泡器械時剪刀口要叉開放，鑷子彎頭要向下放，并加蓋消毒。凡在超凈臺外操作的步驟，各器皿需用蓋子或橡皮塞，以防止細菌落入。

　　二、器材使用時既要注意用火焰消毒，又要防止燙傷、燙死細胞。經火焰消毒后的吸管一定要用Hanks液冷卻。

　　其他

　　一、腫瘤細胞培養成功關鍵

　　腫瘤細胞培養成功關鍵在于：取材、成纖維細胞的排除、選用適宜的培養液和培養底物等幾個方面。在具體培養方法方面，腫瘤細胞培養與正常組織細胞培養并無原則差別，初代培養應用組織塊和消化培養法均可。

　　要點

　　（1）取材

　　人腫瘤細胞來自外科手術或活檢瘤組織。取材部位非常重要，體積較大的腫瘤組織中有退變或壞死區，取材時盡量避免用退變組織，要挑選活力較好的部位。癌性轉移淋巴結或胸腹水是好的培養材料。取材后宜盡快進行培養，如因故不能立即培養，可貯存于 4℃中，但不宜栽過 24小時。

　　培養基

　　腫瘤細胞對培養基的要求不如正常細胞嚴格，一般常用的 RPMIl640、 DMEM、Mc-Coy5A等培養基等皆可用于腫瘤細胞培養。腫瘤細胞對血清的需求比正常細胞低，正常細胞培養不加血清不能生長，腫瘤細胞在低血清培養基中也能生長。腫瘤細胞對培養環境適應性較大，是因腫瘤細胞有自泌（Autocrine）性產生促生長物質之故。但這并不說明腫瘤細胞完全不需要這些成分。按不同細胞需要不同的生長因子；腫瘤細胞與正常細胞之間、腫瘤細胞與腫瘤細胞之間對生長因子的需求都存在著差異。但大多數腫瘤細胞培養中仍需要生長因子。有的還需特異性生長因子〔如乳腺癌細胞等）。總之培養腫瘤細胞仍需加血清和相關生長因子培養更易成功。

　　成纖維細胞的排除

　　成纖維細胞常與腫瘤細胞同時混雜生長，致難以純化腫瘤細胞。而且成纖維細胞常比腫瘤細胞生長得快，最終能壓制腫瘤細胞的生長。因此排除成纖維細胞成為腫瘤細胞培養中的關鍵。

　　二、成纖維細胞排除法

　　機械刮除法

　　是用不銹鋼絲末端插有橡膠刮頭（用膠塞剪成三角形插以不銹鋼絲）、或裹少許脫脂棉制成，裝入試管中高壓滅菌后備用（也可用特制電熱燒灼器刮除）。刮除程序為：

　　（1）標記：鏡下觀察，用不脫色筆在培養瓶皿的背面圈下生長腫瘤細胞的部位；

　　（2）刮除：棄掉培養液，把無菌膠刮伸入瓶皿中，肉眼或顯微鏡窺視下，刮除無標記空間；

　　（3）用 Hanks液沖洗一兩次，洗除被刮掉的細胞；

　　（4）注入培養液繼續培養，如發現仍有成纖維細胞殘留，可重復刮除至完全除掉為止

　　反復貼壁法

　　根據腫瘤細胞比成纖維細胞貼壁速度慢的特點，并結合使用不加血清的營養液，把含有兩類細胞的細胞懸液反復貼壁，使兩類細胞相互分離，操作方法與傳代相同。

　　（1）待細胞生長達一定數量后，倒出舊培養液，用胰酶消化后，Hanks 沖洗 2次，加入不含血清的培養液，吹打制成細胞懸液；

　　（2）取編號為此 A、B、C三個培養瓶；首先把懸液接種入 A培養瓶中。置溫箱中靜止培養 5～20分鐘后，輕輕傾斜培養瓶，讓液體集中瓶角后慢慢吸出全部培養液，再接種入 B培養瓶中后；向 A瓶中補充少許完全培養液置溫箱中繼續培養；

　　（3）培養B瓶中細胞 5～20分鐘后，接處理 A的方法，把培養液注入 C培養瓶中；再向 B瓶中補加完全培養基。

　　當三個瓶內都含有培養液后，均在溫箱中繼續培養。如操作成功，次日觀察可見 A瓶主要為成纖維細胞，B瓶兩類細胞相雜，C瓶可能主要為癌細胞。必要時可反復處理多次，直至癌細胞純化為止。

　　消化排除法

　　此法曾用于乳癌細胞的培養，具體程序是：

　　（1）先是用 0.5%胰蛋白酶和 0.02% EDTA（1：1）混合液漂洗培養細胞一次，然后再換成新的混合液繼續消化，并在倒置顯微鏡下窺視和不時搖動培養瓶，到半數細胞脫落下來后，便立即停止消化；

　　（2）把消化液吸入離心管中，離心去上清，吸入另瓶中，加培養液置溫箱中培養；向原瓶內也補加新的培養液繼續培養。用此法處理后，成纖維細胞比腫瘤細胞易先脫落。經過幾次反復處理，可能把成纖維細胞除凈。

　　膠原酶消化法

　　本法是利用成纖維細胞對膠原酶較為敏感的特點，通過消化進行選擇。

　　（1）可用 0.5 mg/ml的膠原酶消化處理，邊消化邊在倒置顯微鏡下窺視，當發現成纖維細胞被除掉后，即終止消化；

　　（2）用 Hanks洗滌處理一次后，更換新培養液，繼續培養，可獲純凈腫瘤細胞。如成纖維細胞未被除凈，可再次重復。