胰島素受體糖基化的分析實驗

純化的胰島素受體 內切糖苷酶 F 內切糖苦酶 H 神經氨酸酶 甘油 蛋白酶抑制劑儲液 內切糖苷酶 F 緩沖液 內切糖苷酶 H 緩沖液 神經氨酸酶緩沖液 SDS-PAGE 樣品緩沖液

凝膠電泳裝置 X-射線膠片和暗盒

材料與設備

純化的胰島素受體，得自胰島素-瓊脂糖柱層析（見本單元實驗 4）

內切糖苷酶 F(N-聚糖酶；Boehringer Mannheim Corp.903329 或 Genzyme Corp.)

內切糖苦酶 H(Boehringer Mannheim Corp.100117 或 Genzyme Corp.ENDO HI)

神經氨酸酶（Boehringer Mannheim Corp.1080725 或 Sigma Chemical Co.type X,N2133)

凝膠電泳裝置（BioRadLaboratories 或 HoeferScientificInstruments)

甘油（10%)

X-射線膠片和暗盒

試劑

蛋白酶抑制劑儲液（100X)(供糖基化實驗用)

內切糖苷酶 F 緩沖液（5x)

內切糖苷酶 H 緩沖液（10x)

神經氨酸酶緩沖液（10x)

SDS-PAGE 樣品緩沖液（5x)

(配方，見"試劑的配制"，pp.234~240)

搡作程序

1) 按本單元實驗 5 所述的操作程序（步驟 1~5), 對由胰島素-瓊脂糖柱純化的第5 號管的胰島素受體進行親和標記。配制 4 管完全相同的樣品，分別標上 A、B、C 和 D。
注：每管的總體積為 62ul。

2) 建立如下反應體系：

樣品 A(對照)

a. 加 1ul 100x 的蛋白酶抑制劑儲液。

b. 加 17ul H₂O 。

樣品 B(內切酶 F 處理）

a. 加 16ul 5x 內切糖苷酶 F 緩沖液。

b. 加 2ul 內切糖苷酶 F。

c. 加 1ul 100x 蛋白酶抑制劑儲液。

樣品 C(內切酶 H 處理）

a. 加 8ul 10x 內切糖苷酶 H 緩沖液。

b. 加 3ul 內切糖苷酶 H。

c. 加 1ul 100X 蛋白酶抑制劑儲液。

d. 加 6ul H₂O 。

樣品 D(神經氨酸酶處理）

a. 加 8ul 10x 神經氨酸酶緩沖液。

b. 加 3ul 神經氨酸酶。

c. 加 lul 100x 蛋白酶抑制劑儲液。

d. 加 6ul H₂0。

3) 以上樣品于 37°C 孵育 4 h。

4) 加 20ul 5x SDS-PAGE 樣品緩沖液，停止反應。

5) 樣品煮沸 5 min。

6) 加樣于 7.5%SDS-聚丙烯酰胺凝膠上，170V 電壓下電泳，直至染料前沿離開凝膠。（關于 SDS-PAGE 的進一步介紹，見附錄 5。）

7) 將凝膠在 10% 甘油中浸泡 10 min, 然后用干膠器干燥。

8) 用放射自顯影法鑒定親和標記的胰島素受體。