膠質細胞培養

取材及膠質細胞的混合培養

1、P2 SD大鼠經低溫麻醉后以碘酒和75％乙醇消毒，無菌操作下，斷頭放入預冷的D-Hanks液中，在解剖顯微鏡下取大腦皮層并除去腦膜。

2、剪碎組織成1mm3大小，加入胰酶-EDTA消化液并放入37℃孵箱內消化20min，中間搖晃一次。

3、隨后用滴管吸出組織轉移到裝有預冷的MEM＋10％FBS（Glial Medium，GM）的離心管內終止消化液作用5min。

4、吸出組織轉移到另一支裝有冷的GM的離心管內，用火焰拋光的巴斯德滴管吹打數次，靜置后取上清并吸到另一支離心管內。重復上述步驟2～3次。

5、所得上清于800r/min離心5min，棄上清，管內加入新鮮GM并吹打成單細胞懸液。細胞計數，調整細胞密度按1.5×105/cm2種入 25cm2培養瓶，放入孵箱培養。以后每隔2～3d進行全量換液。

搖床振搖分離星形膠質細胞和寡突膠質細胞

培養至7～10天，換液后放入孵箱繼續培養24h，取出擰緊培養瓶蓋，于37℃恒溫搖床上280r/min搖動18h。此時寡突膠質細胞90％以上在培養懸液內而與瓶底貼壁的星形膠質細胞分離。

分離培養懸液內的寡突膠質細胞

吸出懸液至離心管內950r/min離心10min，棄上清后管內加入新鮮GM，吹打成單細胞懸液，按1.5×105/cm2種入預先用100μg /L多聚賴氨酸包被好的35mm培養皿培養。24h后換成DF12＋N2的無血清培養液，此后每三天半量換液1次。

瓶底星形膠質細胞的繼續培養

25cm2培養瓶內的星形膠質細胞用D-Hanks液洗2次后常規傳代，以1.5×105/cm2種入預先用100μg/L多聚賴氨酸包被好的 35mm培養皿培養。培養液為GM，每三天半量換液1次。