胸腺DNA的制備

實驗概要

本實驗介紹了濃鹽法小牛胸腺DNA制備的原理及操作步驟。

實驗原理

DNA在生物體內是以與蛋白質形成復合物的形式存在的，因此提取出脫氧核糖核酸蛋白復合物（DNP）后，必須將其中的蛋白質除去。小牛胸腺，魚類精子和植物種子的胚等含有豐富的DNA，可作為提取DNA的良好材料。動物和植物組織的脫氧核糖核蛋白可溶于水或濃鹽溶液（如1mol/L氯化鈉溶液），但在0.14mol/L鹽溶液中的溶解度很低，而核糖核蛋白（RNP）則溶于0.14mol/L鹽溶液中，利用這一性質可將脫氧核糖核蛋白與核糖核蛋白以及其他雜質分開，當核蛋白與氯仿一起振蕩時，蛋白質變性而與核酸分開，核酸繼續保留于水相中，再用乙醇將水相中的DNA沉淀出來。為除去DNA制品混雜的RNA，可用核糖核酸酶處理。大部分多糖在用乙醇或異丙醇分級沉淀時即被除去，如需要還可以進一步通過柱層析或電泳加以純化。

主要試劑

1. 0.1mol/L氯化鈉-0.05mol/L，pH 7.0檸檬酸鈉緩沖溶液：先配制0.05mol/L，pH=7.0檸檬酸鈉緩沖溶液，然后將氯化鈉溶于此緩沖溶液中，使其最終濃度達到0.1mol/L。

2. 10%氯化鈉溶液；

3. 氯仿-異戊醇混合液（體積比為9∶1）；

4. 95%乙醇及無水乙醇。

主要設備

1. 組織搗碎機

2. 離心機

3. 玻璃勻漿器

實驗材料

小牛胸腺

實驗步驟

1. 取新鮮（或冰凍）的小牛胸腺，除去血水和結締組織，在冰浴上切成小塊，稱取20g，加入2倍體積的0.1mol/L氯化鈉-0.05mol /L，pH=7.0檸檬酸鈉緩沖溶液，于組織搗碎機上高速勻漿5分鐘。

2.  組織糜用轉速為3000r/min的離心機離心15分鐘，將沉淀用50  mL上述緩沖溶液洗滌2次，洗滌時用勻漿器研磨洗滌，每次如前離心。向最后得到的細胞核沉淀中加入6倍體積的10%氯化鈉溶液，充分攪勻置冰箱中過夜，以充分提取DNP，溶液為粘稠狀。將所得的半透明粘稠狀液體，用滴管慢慢注入冷蒸餾水中，邊加邊輕輕攪動（NaCl的最終濃度為0.14mol/L），這時有白色絲狀物-核蛋白析出，在冰箱中靜置數小時，收集沉淀。將沉淀物再溶于4倍體積的10%氯化鈉溶液中，迅速攪拌以加速溶解。加入1/2體積的氯仿-   異戊醇混合液，劇烈振蕩5分鐘左右，用轉速為3000r/min的離心機離心15分鐘，得三層：上層為含有DNA和DNA核蛋白的水層，下層為氯仿-異戊醇的有機溶劑層，變性蛋白質介于兩層之間。

6. 吸出上面的水層，再用氯仿-異戊醇如前進行脫蛋白，直至界面處不再出現變性蛋白質為止。

7. 最后吸出上清液并將其注入兩倍體積的95%乙醇中，用玻璃棒攪起白色纖維狀DNA沉淀，瀝干，用80%乙醇洗滌，最后用少量無水乙醇洗滌。盡量瀝干乙醇后，鋪開在表面皿上。置于真空干燥器內干燥，即得白色纖維DNA鈉鹽。

注意事項

1. 由于DNA主要存在于細胞核中，為了便于提取DNA，應嚴格控制胸腺破碎的條件，既要將細胞膜破碎，又要盡可能避免細胞核被破壞，導致DNA釋放而被斷裂。

2. 在用氯仿-異戊醇除去組織蛋白時，要劇烈振蕩使蛋白變性。若振蕩不夠，蛋白質不能很好除去，則影響DNA制品的質量