脂溶性維生素的測定

一、維生素A

目前維生素A都是合成的，來源：（1）從動物肝臟中得到；（2）從維生素前體而得到（維生素前體：主要指類胡蘿卜素，主要是β-胡蘿卜素）

維生素A的測定常用的方法有三氯化銻比色法、紫外分光光度法、熒光分析法、液相色譜法。

對于三氯化銻比色法適用于樣品中含V_A高的樣品，方法簡便、快速、結果準確，但是對維生素A含量低的樣品，如每克樣品中含5～10μg維生素A時，這時樣品由于受其脂溶性物質的干擾，不應用比色法測定。

對于紫外分光光度法不必加顯色劑顯色，可直接測定維生素A的含量，對樣品中含V_A低的也可以測出可信結果，操作簡便、快速。

1、維生素A的性質

⑴ 因有許多不飽和鏈，故見光易分解；

⑵ 在缺氧情況下，對熱較穩定，對光特別敏感。如測強化奶粉時，速度要快，一般要求測定時間長短，因為時間長，見光時間長，見光分解，故測出的比出廠的含量要少；

⑶ 對堿穩定；

2、測定步驟

⑴ 樣品用有機溶劑萃取脂類

樣品可以根據脂肪的測定處理脂肪，即索氏抽提法，采用乙醚作提取劑，也可用熱苯回流方法提取脂類。如果樣品中含蛋白質和淀粉多的情況下可采用乙醚提取法。

⑵脂類的皂化

脂類有維生素和脂肪這兩部分通過皂化（50%KOH、無水C₂H₃OH、熱回流）把它們分開，得到一部分皂化物和一部分不皂化物。

皂化條件：

（1）C₂H₃OH︰脂類 = 8︰1；

（2）KOH量 = 脂量×皂化價（mg）×2.5；

（3）皂化溫度與時間：70℃、30分鐘

在皂化時可以加入抗氧劑連苯二酚和對苯二酚，防止氧化。

⑶ 提取：不皂化物和皂化物經水、苯、乙醚萃取可得到不皂化物。

⑷ 柱層析分離干擾物質

采用柱層析分離干擾物質，如果柱層析把β-胡蘿卜素也洗脫下來，那么這時維生素A與β-胡蘿卜素就是一個混合物，還要將它們分離開。如果樣品中只有維生素A而不含β-胡蘿卜素時，這時可直接定容。

維生素A與β-胡蘿卜素分離：

吸附劑：  8分中性Al₂O₃和2分堿性Al₂O₃混合，裝柱

分離方法：a. 用2%丙酮石油醚洗β-胡蘿卜素；

            b. 用乙醚洗V_A。

3、測定方法

⑴ S_bCl₃比色法

維生素A／CHCl₃ ＋ S_bCl₃／CHCl₃→形成蘭色物質→在620nm有最大吸光峰

這種蘭色物質不穩定，很快褪色或變成其它物質，所以在分析時最好在暗室中進行，并且做標準曲線。

計算：每百克樣品含V_A的量= C×（V1/V2）×（100/W）

C ：從標準曲線上查得V_A的量

V₁ ： CHCl₃定容的量

V₂ ： 測定所取樣液體積

⑵ 紫外分光光度法

a. 原理：

V_A為脂溶性的，測定V_A時必須先將樣品中的脂肪抽提出來進行皂化，萃取不皂化部分，在經柱

層析除去雜質等干擾物質，在紫外328nm下測定，求出含量。

b. 方法

1） 提取及皂化

稱樣10.00g → 于燒杯中 → 加40ml水攪勻 → 移250ml分液漏斗中 → 加氨水5ml → 加乙醇35ml →

搖勻 → 用乙醚抽提（每次40ml抽提三次） → 收集乙醚層 → 用10ml水洗乙醚層三次 →水層再

用30ml乙醚抽提一次 → 合并所用乙醚 → 用索氏法除乙醚→ 待瓶中乙醚除盡后 → 加30ml80%

的KOH → 40mlC₂H₅OH →加0.8g焦性沒食子酸 → 83℃水浴30分鐘（皂化脂肪）→ 冷卻后移入

250ml分液漏斗中 → 加60ml水 → 用40ml乙醚抽提三次 →合并乙醚抽提液 → 用水洗至中性 →

用索氏法除乙醚 → 除去后用5ml石油醚溶解瓶中內容物 → 然后移入刻度試管中

2）層析

在層析柱內裝200px高度中性氧化鋁 → 50px高度堿性氧化鋁及25px無水硫酸鈉 → 以石油醚浸透 → 裝皂化后的樣液慢慢于柱內→ 用1～2ml石油醚洗試管 → 洗液倒入柱內，活塞打開以每分鐘為35滴左右的速度打開，當液面降到接近硫酸鈉時 → 加5ml石油醚→ 隨后用5ml洗脫液逐次洗滌。

層析柱上第一個黃色層析層，一般是β-胡蘿卜素，此帶在12%洗脫液前后洗去，收集于10ml容量瓶中直到流出物不呈黃色為止，此層可測β-胡蘿卜素用，而V_A一般在50%洗脫液洗出，用2ml刻度吸管收集1ml。吸約0.2ml于小試管中→加0.3ml25%三氯化銻→溶液如呈蘭色→表明有V_A存在，故0.5ml用石油醚定容10ml。

3）樣液測定

以石油醚為空白

4）計算                                             

VA(I.μ100G)=(E×10⁶×2)/(1830×100×W)×(1000/0.3)    

0.3 ：每0.3μg V_A相當于1 I.μ

E ： 消光值            W ： 樣品重量（g）

1830 ：石油醚中其消光值1%cm為1830

（I.μ）： 一個國際單位，維生素A相當于0.6 μgβ-胡蘿卜素。

4、試劑

⑴ 50%KOH；⑵ 無水硫酸鈉；⑶ 乙醚（不含過氧化氫）；⑷ 石油醚；⑸ 苯；

⑹ 45%C₂H₅OH（應不含醛類物質）

酒精中含醛類的檢查方法：

首先配銀氨溶液，在50%硝酸銀溶液中加入濃氨水，直到氧化銀沉淀又重新溶解為止，在小試管中加2ml銀氨溶液，加3～5滴酒精，搖勻，加10%N_aOH 1滴加熱，若有銀鏡反應，表示乙醇中含有醛。

脫醛處理：

取乙醇2000ml → 加A_gNO₃2g → 振搖溶解 → 加NaOH 4g →振搖溶解 → 過濾 → 上清液 → 蒸餾 → 即可

⑺ 20～25% S_bCl₃的CHCl₃

先量取100mlCHCl₃于廣口瓶中，用減差法稱取一定量的干燥S_bCl₃，S_bCl₃易吸水，所以必需蒸餾重結晶后使用，一般用沙浴上加熱。

二、維生素D

維生素D在魚肝油和雞蛋黃等食品中含量較多，一般成人不會缺V_D，而嬰兒容易缺乏。

1、操作步驟

⑴ 提取 

樣品（奶粉）＋水→混勻 在NH4OH的作用下酪蛋白Ca鹽溶解加入乙醇使脂肪球分離→乙醚、石油醚萃取得到脂質（其它樣品可用索氏提取得到脂質）　

⑵ 皂化

在奶粉中脂溶性物質有V_D、β-胡蘿卜素、V_A、V_E、甾醇、脂肪。

目前皂化有三種情況：

低堿 = 脂肪︰KOH為1︰2.5的關系

另外在皂化時加抗氧化劑與不加抗氧化劑回收率不一樣，加抗氧化劑的回收率高于不加抗氧化劑的回收率。

有人將上面的皂化條件互補，采用中溫-高堿并加抗氧化劑，這樣的回收率為96.8%，效果較好。

故皂化條件 ：70℃±2℃高堿 + 抗氧化劑

⑶ 萃取

⑷ 除甾醇

甾醇在食品中含量較多，主要是通過柱子，這個柱子就是毛地黃皂甙。

甾醇 + 毛地黃皂甙 → 沉淀

洗脫液用乙醚︰己烷 = 1︰5配制而成

甾醇︰毛地黃皂甙    = 1︰14 用量

⑸ 皂土柱層析

當V_D與V_A共存時，須用皂土柱層析除V_A及V_A的分解產物。

測定方法有兩種：

比色法：
維生素A／CHCl₃ ＋ S_bCl₃／CHCl₃／乙酰氮 → 形成橙黃色物質 → 500 nm下測定

紫外分光光度法　

V_D／乙醇 → 265 nm下測定