脂筏的分離和應用（一）

基本方案通過蔗糖梯度浮選 法 制備 去 污劑 抗 性的 膜 并 通 過免 疫 印 跡 對蛋 白質進行分析

材 料

細胞，貼壁或非貼壁

N E /P 緩沖液，單獨或包含以下一種或多種組分：

1 % 、 2 % 或 5 % (W V ) TritonX-IOO

0.lmol/L 碳酸鈉， pHll

5 % 、 3 5 % 或 8 0 % (m /V ) 蔗糖

60m m o l /L 辛基葡糖苷

T N E 緩沖液

去污劑相容的蛋白質檢測試劑盒（如 Bio-Rad)

2 X 或 6 X S D S /樣品緩沖液

丙 酮（可選），冰冷的

乙 醚（可選）

I O c m 的 組 織 培 養 皿（用于貼壁細胞）

22 G 針頭

I m l 和 5m l 的注射器

S W 4 1 轉子和超速離心管（B e c k m a n )

對于貼壁細胞，無需進行比較的細胞系

la. 將細胞鋪于 2 個 I O c m 組織培養皿中，生長至細胞匯合。對 于 D R M 脂 質 分 析（見輔助方案3)，則接種細胞至5 個 培 養 皿 或 1 0 個培養皿以定量磷脂酰絲氨酸、磷脂酰肌醇或含量稀少的神經節苷脂。

2a. 用 I m l 含 有 1 % 或 2 % Triton X -100 的 T N E / P 緩沖液置冰上裂解細胞20 min。如果有必要，在裂解緩沖液中加入0. lmol/L 碳酸鈉， p H l l ，以便更好地定量D R M 脂類得率，提 高 D R M 脂質得率，或減少外周或細胞骨架蛋白與D R M 的結合。在分析 D R M 中的酶活性時，不能使用碳酸鹽。

3a. 用細胞刮或橡皮刮將培養皿細胞裂解物刮下來，收于管中。

4a. 如果溶解緩沖液含有碳酸鹽，將裂解液通過帶 22 G 針 頭 的 5m l 注 射 器 1 0 次（保持裂解產物低溫）用于剪切 D N A ，以確保D R M 移至正確的梯度。

對于貼壁細胞，細胞間需進行比較的細胞系

lb. 如需比較兩個不同的細胞類型間D R M 的豐度和得率，按照步驟Ia所示用培養皿培養不同細胞類型的細胞，對每種細胞另接種一個培養皿（以測定培養物的蛋白質含量），確保每個培養皿的細胞數相同。

2b. 用 5 ml T N E 緩沖液漂洗每種類型細胞的一個培養皿2 次 ，用 I m l 含 有 1 % TritonX -100或 者 0. lmol/L 碳酸鈉的 T N E /P 緩沖液裂解細胞。將黏稠的細胞裂解物立即轉 移 至 1.5m l 微量離心管內，并 通 過 22 G 針頭連接的 I m i 注 射 器 1 0 次（或直到黏滯性消失）以剪切D N A 。然后以最大速度離心。

3b. 用去污劑相容的蛋白質檢測試劑盒測定5?IOul等份裂解物的蛋白質含量。將 T N E緩沖液與含有2 % 或 5 % Trit〇n X -100的 T N E 緩沖液混合，來制備含有足量TritonX -100的 T N E /P 緩沖液，使 用 去 污 劑 ：蛋 白 質 為 10 : I (m /m ) 混 合 。為增加與脂筏結合較弱蛋白質的得率，使用去污劑：蛋白質為2 : 5 (m /m ) 混合。

4b. 加 入 I m l 含 有 1 % Triton X -IOO 的冰冷T N E /P 緩沖液至剩余的培養皿中，在冰上裂解細胞20 min，在裂解緩沖液中加入0.lmol/L 碳酸鈉， p H l l ，以便更好地定量D R M 脂類得率，提 高 D R M 脂質得率，或減少外周或細胞骨架蛋白與D R M 的結合 。在分析 D R M 中的酶活性時，不能使用碳酸鹽。按照步驟3a 所示操作；如果有必要，按照步驟4a 所示操作。

對于非貼壁細胞

Ic. 培養約5X 107個細胞，并 4°C ， 200g離 心 5 min。如需進行細胞間的比較時，應使細胞(來源相同）數量相同。對于脂類分析（見輔助方案3)，使 用 2X 108的非貼壁細胞。

2c. 用 5m l 冰 浴 的 T N E 緩沖液重懸細胞，重 復 洗 2 次 。

3c. 用 2m l 含 有 1 % 的 Triton X -100的 T N E /P 緩沖液在冰上裂解細胞20 min。在裂解緩 沖 液中加入〇.lmol/L 碳 酸 鈉 ， p H l l ，以 便 更 好 地 定 量 D R M 脂 類 得 率 ，提髙D R M 脂質得率，或減少外周或細胞骨架蛋白與D R M 的結合。在 分 析 D R M 中的酶

活性時，不能使用碳酸鹽。

4c. 如果有必要，按照步驟4a 進行操作。

5 . 將裂解產物與含有8 0 % 蔗 糖的冰冷T N E /P 緩沖液混合。對于來自貼壁細胞的裂解物 ，需要上述加至培養皿中的裂解緩沖液總體積為1.25倍 體 積（即對于 步 驟 3a 或4b 收集的裂解物，加 1.25 ml)。對于非貼壁細胞的裂解物，加 2. 5m l 。完全混合并靜置幾分鐘以便減少泡沫。

6 . 轉移至一個或多個S W 4 1 超速離心管內，移去可能存在的泡沫。每管不超過5 ml。用冰冷的含有3 5 % 蔗 糖 的 T N E /P 緩 沖 液 6?7m l 小心地覆蓋到裂解物/蔗糖復合物上(分層應盡可能的寬），開始倒入液體時應注意觀察以確保其可以浮在上層。如果沒有浮起，則從微量離心管中移去混合物，并徹底混合。如果必要的話，加入少量的8 0 % 蔗糖。

7 . 用 含 5 % 蔗 糖 的 冰 冷 T N E /P 緩 沖 液 填 充 離 心 管 至 距 離 頂 端 約 3m m 。配 平 ， 4°C ，l 〇0 00Qg 離心> 3 h (至 24 h)。

蛋白質梯度分布的檢測

8a. 從底端分段收集梯度上的成分，每 份 收 集 lml。加 2 X 或 6 X S D S /樣品緩沖液，通過 SDS-P A G E (單 元 12. 3 ) 和 免 疫 印 跡 法（單 元 12. 5 ) 分析其中 50?100ul 組分。

對于無需免疫沉淀的免疫印跡

8b. 用 5m l 注 射 器 22 G 針頭從離心管的頂端在 5%/35% 蔗糖交界處收集可見的條帶置于 1 個 S W 4 1 超速離心管中。用 冰 冷 的 T N E /P 緩沖液稀釋該膜成分，直到注滿離心管。 4°(：， 100 00(^離心 111。

9b. 移棄上清液。用 100?2 0 0 4 T N E /P 緩沖液移出沉淀物并移至一微量離心管內。用200ul T N E /P 緩沖液清洗超離心管 3 次 ，刮擦管底部以收集沉淀物碎片。將這些清洗液與沉淀物合并。

10b. 4°C ，最高轉速離心 IOmin 以沉淀 D R M 。棄上清液。直接用 2X 或 6X S D S /樣品緩沖液溶解 D R M ，通 過 SDS-PAGE (單元 12. 3 ) 和 免 疫 印 跡（單 元 12. 5 ) 進行分析。

對于低分子質量蛋白質

8c. 依步驟 8b?IOb 制 備 D R M 沉淀物，不 用 S D S /樣品緩沖液來溶解。加 I m l 冰冷的丙酮 至 D R M 沉淀物里，渦旋混勻，置 冰 上 孵 育 lOmin。 4°C ，最 高 轉 速 離 心 lOmin，移棄丙酮。

9c. 在室溫下加 I m l 二乙基醚至管內，渦旋混勻，如上述操作進行沉淀。移去醚并風干。用 2 X 或 6X S D S /樣品緩沖液溶解 D R M 蛋白，以 S D S - P A G E (單 元 12. 3 ) 和免 疫 印 跡 法（單 元 12. 5 ) 進行分析。

免疫沉淀后的免疫印跡

8d. 依照步驟 8b?IOb 制 備 D R M 沉淀物，不 用 S D S /樣品緩沖液來溶解。用 I m l 含有1 % Triton X -IOO 的 T N E /P 緩 沖 液 溶 解 D R M ，置 37°C 孵 育 5 min，或 者 加 入 Iml含 有 60m m o l /L 辛（烷）基葡糖苷的 T N E /P 緩沖液，置冰上孵育 20 min。

9d. 4°C ，最高轉速離心 5 min，以沉淀任何殘存的不溶性物質。將澄清的可溶性 D R M移至新管，通 過 免 疫 共 沉 淀 試 驗（單 元 12. 2 ) 回收目的蛋白，以 S D S - P A G E (單元 12. 3 ) 和 免 疫 印 跡 法（單 元 12. 5 ) 進行分析。

備 選 方 案 用 離 心 法 制 備 去 污 劑 抗 性 的 膜