脂肪來源干細胞的取材與分離實驗

人和小鼠的脂肪組織均可用于分離ASC，可以獲得相當數目的ASCs。人脂肪組織通常來源于抽脂。小鼠脂肪組織則取自腹股溝處脂肪墊。

(a)37℃水浴中預熱HBSS和ASC培養基。

(b)麻醉動物后處死。

(c)轉移動物至層流凈化罩中。

(d)70%酒精消毒腹部。

(e)采用低位橫向切口打開腹腔。

(f)用鑷子取出性腺/附睪和腹股溝處的脂肪墊。

(g)將脂肪置于培養皿中，加入HBSS。

(h)待所有動物脂肪取出后，將脂肪轉移至新的培養皿中。

(i)加人含有5%聚乙烯吡咯烷碘酮的HBSS 2?3 min。

(j)漂洗組織并用HBSS洗滌脂肪。

(k)用無菌鑷子將脂肪轉移至50 ml離心管中。

(l)用無菌剪刀將脂肪切碎。

(m)加入與組織體積相同的膠原酶溶液并混勻。

(n)將離心管置于37℃水浴中60 min,其間不時混勻一下。

(o)離心，50?100 g，5 min。

(p)取出離心管，用力搖晃（將基質細胞與原代脂肪細胞完全分離），再次離心5 min。.

(q)小心吸去上層油脂，油脂層中含有原代脂肪細胞，注意不要破壞位于下方的基質-血管細胞層。

(r)加人5?10 ml PBSA,重懸沉淀，再次離心5 min。

(s)洗滌三次，注意不要吸走基質-血管細胞層。

(t)最后一次洗滌后，加人8 ml ASC培養基重懸沉淀，轉移至T25培養瓶中，置于37℃,5% CO₂溫箱中。

(u)待細胞貼壁生長2?4天后換液。

(v)換液時通過棄去培養基，從而去除未貼壁的細胞。

(w)以后每周更換培養基2次。