脂質體介導的細胞轉染實驗

實驗概要

學習和掌握外源基因導入真核細胞的主要方法—脂質體介導的轉染。了解外源基因進入的一般性方法，觀測外源蛋白的表達（綠色熒光蛋白），為染色準備實驗材料。

實驗原理

外源基因進入細胞主要有四種方法：電擊法、磷酸鈣法和脂質體介導法和病毒介導法。電擊法是在細胞上短時間暫時性的穿孔讓外源質粒進入；磷酸鈣法和脂質體法是利用不同的載體物質攜帶質粒通過直接穿膜或者膜融合的方法使得外源基因進入細胞；病毒法是利用包裝了外源基因的病毒感染細胞的方法使得其進入細胞。但是由于電擊法和磷酸鈣法的實驗條件控制較嚴、難度較大；病毒法的前期準備較復雜、而且可能對于細胞有較大影響；所以現在對于很多普通細胞系，一般的瞬時轉染方法多采用脂質體法。
利用脂質體轉染法最重要的就是防止其毒性，因此脂質體與質粒的比例，細胞密度以及轉染的時間長短和培養基中血清的含量都是影響轉染效率的重要問題，通過實驗摸索的合適轉染條件對于效率的提高有巨大的作用。

本次實驗采用的脂質體是promega公司的TransFast脂質體試劑，它是一種陽離子脂質體和中性脂質體的混合物，是對于本次實驗中采用的293T細胞優化的轉染試劑。

主要試劑

1. DMEM培養基
2. 鏈霉素/青霉素（雙抗）
3. FCS（小牛血清）
4. PBS（磷酸鹽緩沖溶液）
5. 胰酶/EDTA消化液
6. 轉染試劑（TransFast）

主要設備

1. 20ul/200ul/1ml微量移液器和Tip頭
2. 酒精燈
3. 廢液缸
4. 血球計數板
5. 渦旋振蕩器
6. 恒溫水浴箱
7. 臺式離心機
8. 35mm培養皿
9. 轉染管
10. 15ml離心管
11. 觀察用倒置顯微鏡
12. 熒光顯微鏡和CCD

實驗材料

1. 293T細胞
2. MyoD表達質粒和EGFP表達質粒

實驗步驟

1. 細胞傳代
   1) 試驗準備：200ul/1mlTip頭各一盒（以上物品均需高壓滅菌），酒精棉球，廢液缸，試管架，微量移液器，記號筆，培養皿，離心管。
   2) 棄掉培養皿中的培養基，用1ml的PBS溶液洗滌兩次。
   3) 用Tip頭加入1mlTrypsin液，消化1分鐘（37℃，5%CO₂)。用手輕拍培養瓶壁，觀察到細胞完全從壁上脫落下來為止。
   4) 加入1ml的含血清培養基終止反應。
   5) 用Tip頭多次吹吸，使細胞完全分散開。
   6) 將培養液裝入離心管中，1000rpm離心5min。
   7) 用培養液重懸細胞，細胞計數后選擇0.8X10⁶個細胞加入一個35mm培養皿。
   8) 將合適體積完全培養液加入離心管中，混勻細胞后輕輕加入培養皿中，使其均勻分布。
   9) 將培養皿轉入CO₂培養箱中培養，第二天轉染。
2. 細胞轉染
   1) 轉染試劑的準備
      a. 將400ul去核酸酶水加入管中，震蕩10秒鐘，溶解脂狀物。
      b. 震蕩后將試劑放在－20攝氏度保存，使用前還需震蕩，。
   2) 選擇合適的混合比例（1：1－1：2/脂質體體積：DNA質量）來轉染細胞。在一個轉染管中加入合適體積的無血清培養基。加入合適質量的MyoD或者EGFP的DNA，震蕩后在加入合適體積的轉染試劑，再次震蕩。
   3) 將混合液在室溫放置10—15分鐘。
   4) 吸去培養板中的培養基，用PBS或者無血清培養基清洗一次。
   5) 加入混合液，將細胞放回培養箱中培養一個小時。
   6) 到時后，根據細胞種類決定是否移除混合液，之后加入完全培養基繼續培養24－48小時。
3. 第二次細胞傳代
   1) 在轉染后24小時，觀察實驗結果并記錄綠色熒光蛋白表達情況。
   2) 再次進行細胞傳代，按照免疫染色合適的密度0.8X10⁵個細胞/35mm培養皿將細胞重新粉入培養皿中。
   3) 在正常條件下培養24小時后按照染色要求條件固定。

注意事項

1. 細胞

    1)  分裂細胞相比較非分裂細胞——分裂細胞往往要比靜止細胞更易于攝取并表達外源DNA。因此對大多數轉染操作而言，細胞都在轉染當天或前一天種板。同樣重要的是細胞在種板進行轉染時不應處于過度生長的狀態；此外，還常用促有絲分裂刺激物（如，病毒轉化，生長因子，條件培養基，以及滋養細胞）來活化原代培養細胞。

   2) 貼壁細胞相比較懸浮細胞——在轉染效率方面貼壁細胞和懸浮細胞之間的差異顯著。相對于貼壁細胞（如HEK，CHO），懸浮細胞（如HL 60，Jurkat）非常難以轉染，可能是因為細胞間膜結構的差異，但目前還沒有分子水平上合理機制的解釋。

   3) 分板方案——在對培養細胞進行分板傳代培養之前，必須把貼壁細胞用胰蛋白酶消化使之脫離培養基質。這個常規操作可導致正常細胞功能受到嚴重損害。因此分批方案的不同（如，胰蛋白酶消化時間的長短，胰蛋白酶的滅活等）需要優化。

    4)  傳代次數——傳代次數是指對一個細胞系進行分批傳代的頻度（通常在一個實驗室范圍內）。某些細胞系相比較其他細胞系而言較不穩定，可能會隨著培養時間的延長而改變，視不同的細胞系和培養條件而定。因此名稱相同的同一細胞系在生理學和形態學（以及轉染能力）性質也可能會有很大的差異。一般而言，細胞在凍存復蘇后的一兩代之內或直到它們完全復蘇之前都很難轉染。

    5)  細胞數量（融合率）——只要培養基質（組織培養皿）尚有空間，細胞就會按指數規律分裂。對于正常細胞而言，細胞生長的速度受細胞密度大小的抑制（接觸抑制），但癌細胞則不受此限制而會繼續生長并可互相疊加。營養物質的耗竭以及代謝廢物的積聚會影響所有的細胞生長。細胞會因受到營養物質匱乏的壓力而不適于轉染。報告基因的表達率與轉染開始時的細胞數量和細胞健康以及細胞溶解之前的生長情況相關。

   6) 培養物污染——培養物可被細菌、酵母、真菌、病毒、支原體、甚至其他細胞種類所污染。各種污染都會導致產生錯誤的結果。

    7)  支原體污染——支原體污染在所有培養細胞中的比例為5-35%，它可改變細胞生長特性，酶的作用途徑，細胞膜的組成，染色體結構，以及轉染效率。特別是，支原體對采用脂質、DEAE-右旋糖酐、磷酸鈣或腺病毒介導的轉染技術有所干擾，其結果致使非典型轉染或轉染效率偏低。這些影響會導致實驗結果的不可靠以及時間和珍貴細胞系的損失。和細菌及真菌不同，支原體污染無法通過視覺檢查發現。它們非常小甚至能夠通過大多數的無菌濾膜；它們還對常用抗生素有抗藥性。所以必需進行支原體污染的常規篩查。

2. 交叉污染

如果同一個實驗室同時培養不同種類的細胞，那就有可能發生交叉污染，即使遵循最嚴格的分離操作規程這種情況也有可能發生。如有許多細胞系被HeLa   細胞所污染。和其他細胞系之間的交叉污染不總是能通過鏡檢發現。如果有少量某種生長快速的細胞摻入到培養細胞種，幾個月過后它們就會完全取代目標培養物。

3. 載體DNA

一般原則：對純化所得的載體進行質量鑒定。確定維持其正常功能的基因序列是否適合于您的細胞體系。在測定細胞體系的參數時，一定要選用一種已知具有功能的載體做對照。

   1) 載體的完整性——載體是否具有功能取決于它結構的完整性。轉染效率受到質粒制備物的超螺旋結構和舒展結構之間比例、雙螺旋斷裂、核酸酶的降解，以及來自于儲存和處理過程中的物理壓力的影響。

   2) 載體制備物——各種載體是按照不同的方案在細菌體系中制備并純化。制備產物中殘余的污染物（如CsCl，內毒素）可能會影響轉染效率。

    3)  載體構造（啟動子/增強子/ORI）—轉染體系通常用帶有強病毒調節元件（如，RSV，CMV，和SV40）的對照載體進行優化和比較。然而，病毒啟動子/增強子體系的相對有效性在不同細胞系間的差異可大到兩個數量級。例如，在某些細胞系中，由于自發的質粒擴增，SV40體系可高效表達large  T抗原（如，COS）；而在其他許多細胞系中，則是CMV啟動子更為有效。

除此之外，各種CMV載體的表達率也會有超過一個數量級的差異，這部分是由于載體中其他調節元件所引起的。