脈沖場凝膠中濃縮DNA片段的回收

瓊脂糖酶 基因組 DNA

平衡緩沖液 注射 轉染緩沖液

NuSieve GTG Agarose minigel 點滴透析的膜 水浴

一、材料

1. 緩沖液和溶液

平衡緩沖液（1X TBE，100 mmol/L NaCl，30 μmol/L 精胺，70 μmol/L 亞精胺）

溴化乙錠（1 μg/ml) 或適當稀釋度的 SYBR Gold

注射/轉染緩沖液（10 mmol/L Tris-Cl (pH 7.5)，0.1 mmol/L EDTA，100 mmol/L NaCl，30 mmol/L 精胺，70 μmol/L 亞精胺）

2. 酶和緩沖液

瓊脂糖酶

3. 凝膠

NuSieve GTG Agarose minigel (5%)

4. 核酸和寡核苷酸

DNA 分子質量標準

低熔點瓊脂糖栓包埋的基因組 DNA

5. 專用設備

點滴透析的膜（孔徑 0.05 μm)

設置 65~68℃ 及瓊脂糖酶消化的適宜溫度的水浴

二、方法

1. 準備制備低熔點瓊脂糖 PFGE, 它將提供分離目的 DNA 片段的最佳分辨率。

2. 制備槽的兩側加樣孔分別加入 DNA 分子質量標準和單個酶切基因組 DNA 的凝膠栓。 將制備樣品加入制備槽。

3. 電泳結束后，切下含有分子質量標準和單個基因組 DNA 栓的泳道，室溫溴化乙錠或 SYBR Gold 染色 30 min。如果需要可以水中脫色 30 min。不要染制備泳道。

4. 紫外照射檢査染色切片，在切片目的 DNA 的側面做上刻痕標記。

5. 普通照明下，重新把染過色的分子質量標準和單個栓的凝膠組合起來，將未染色的制備泳道中的目的 DNA 大致定位。仔細地用干凈剃刀割下這個區域，把凝膠切片轉移到帶蓋聚丙烯管中。

6. 室溫下用 40 ml 平衡緩沖液平衡含有分離 DNA 分子的凝膠切片 20~30 min。其間始終輕輕振動混合物。

7. 倒去緩沖液，65~68℃ 熔化凝膠。熔化時旋轉小管以確保熔化完全。記錄下熔化凝膠切片的體積。

8. 5% NuSieve GTG 微型膠仍在膠帶圍成的模具上時，在凝膠的頂層切去足夠的體積以容納熔化的含有 DNA 的凝膠切片。

9. 將熔化的凝膠切片倒入其中，凝固。60V 恒定電壓，以毎毫米低熔點凝膠電泳 12 min, 將分離的 DNA 泳入 5% 的凝膠中而濃縮。

10. 電泳結束后，由膠的中心切下薄薄的一片，溴化乙錠染色。確定 DNA 遷移入膠的長度（通常約 2 mm)。

11. 除去凝膠中的低熔點部分，將含有濃縮 DNA 的 5% 凝膠切割的盡量小。

12. 在含有 100 mmol/L NaCl、30 μmol/L 精胺、70 μlmol/L 亞精胺的 12 ml 1x 瓊脂糖酶酶切緩沖液中平衡凝膠切片。室溫下輕輕振動溫育 20 min。

13. 倒出緩沖液，將凝膠切片轉入微離心管，65~68℃ 熔化。將熔化的凝膠轉入水浴，水浴溫度設置在瓊脂糖酶作用的適宜溫度（商家推薦)。

14. 溫育熔化的凝膠 15 min, 按 5% 凝膠的初始體積加入適量的瓊脂糖酶消化。

15. 消化后，臺式離心機以最大轉速離心 5 min 沉淀碎片，將上清轉入新的離心管。

16. 用 0.05 μm 孔徑的點滴透析膜透析所得上清。

(1) 將上清點在膜的中心，光面向上浮于 100 ml 注射/轉染緩沖液。

(2) 室溫下透析 1 h。換掉原緩沖液，重新加入 100 ml 注射/轉染緩沖液再透析 1 h。

(3) 將 DNA 轉入新的微量離心管。