腺病毒介導EGFP基因轉染神經干細胞

摘要： 本實驗從新生SD大鼠海馬組織中分離神經干細胞，并通過觀察攜帶EGFP基因的腺病毒（Ad/ EGFP）轉染NSCS后EGFP表達規律及轉染對NSCS的活力、增殖、分化等的影響，探討EGFP作為NSCS的示蹤標志物的可行性，為進一步的NSCS移植研究提供體外研究基礎。

神經 干細胞 （NSCS）是指一類具有多分化潛能（能分化為神經細胞、 星形膠質細胞 、少突膠質細胞），能 自我更新 和克隆性增殖的一群細胞。在NSCS 移植 研究中，有必要對NSCS進行示蹤標記，以便實時跟蹤和區分植入的NSCS和宿主細胞。

綠色 熒光蛋白 （green fluorescent protein，GFP）基因是一種新的報告基因，其表達產物GFP可在紫外光或藍色光激發下穩定地發出綠色熒光，不需要任何底物或輔助因子。在GFP的基礎上進行F64L和S65T 突變 后的增強型綠色熒光蛋白（EGFP）進一步增強了GFP的熒光性能，使結果更容易觀察檢測。

本實驗從新生SD大鼠海馬組織中分離 神經干細胞 ，并通過觀察攜帶EGFP基因的腺 病毒 （Ad/ EGFP）轉染NSCS后EGFP表達規律及轉染對NSCS的活力、增殖、分化等的影響，探討EGFP作為NSCS的示蹤 標志物 的可行性，為進一步的NSCS移植研究提供體外研究基礎。

1  材料和方法

1.1  動物

24 h之內的新生SD大鼠。

1.2  主要試劑和儀器

DMEM/F12、B27、bFGF（堿性 成纖維細胞 生長因子）、EGF（ 表皮生長因子 ）均購自Gibco公司 。 抗體 為:Nestin兔抗鼠多克隆抗體（博士德公司），GFAP單克隆抗體（Sigma公司），β-Ⅲ tubulin 單克隆抗體（Sigma公司），生物素標記山羊抗小鼠IgG（北京中杉生物試劑公司），山羊抗兔Cy3-IgG（博士德公司），DAB（北京中杉生物試劑公司） ，胎牛血清（FBS，杭州四季青生物試劑公司）。儀器：CO2 培養箱 （Thermo，美國） ，熒光倒置相差 顯微鏡 （Olympus IX70，日本）。病毒載體：Ad/EGFP，滴度為2×1011pfu/L。

1.3  方法

1.3.1  NSCS的分離、培養及鑒定

取新生大鼠置于0.5%碘伏中消毒，取腦，分離海馬，剝離腦膜血管，將海馬組織移入含有2%B27的高糖DMEM/F12培養液中，盡量將組織剪碎，輕輕吹打制成細胞懸液，400目篩網過濾，臺盼藍染色，細胞計數，以2×106個/L接種到6孔培養板內，最后加入EGF（終濃度20 μg/L）和bFGF（終濃度20 μg/L），置37℃、5%CO2平衡濕度培養箱中。

每2～3天半量換液1次，每7～10天傳代1次。對第3代培養7天的細胞球參照文獻［3］用Nestin免疫熒光染色法進行鑒定，熒光倒置相差顯微鏡觀察拍照。

1.3.2  Ad/EGFP轉染NSCS

把第3代培養7天的細胞按2×105個/孔接種到24孔板，每孔加入DMEM/F12+EGF+bFGF培養液1 ml，轉染前1天半量換液。實驗分為5組， 感染 復數（multiplicity of infection，MOI）分別為0∶1（對照組）、10∶1、20∶1、50∶1、100∶1，每組設8孔。

根據感染復數計算加入所需腺病毒懸液的體積數，在EP管中將所需的腺病毒懸液與無血清的DMEM/F12培養液混合，將混合液按照分組分別加入到每組細胞中，每孔0.2 ml。將24孔板置于37℃、5%CO2培養箱中培養，4 h后用DMEM/F12清洗細胞2次，棄病毒殘液。

每8 h觀察EGFP的表達情況，常規半量換液。轉染后48 h，在200倍熒光顯微鏡下，隨機選取5個視野，分別計算綠色熒光陽性細胞百分數，用以代表Ad/EGFP對NSCS的轉染效率。

1.3.3  Ad/EGFP體外轉染對神經干 細胞增殖 的影響

各組分別在第7天、第14天、第21天細胞傳代時各取100 μl，用臺盼藍染色并計算細胞活力，計算公式為 ：細胞活力（%） = （細胞總數-死亡細胞數）/細胞總數×100%。并在100倍顯微鏡下，各組選取培養板4角的4個區域及中央1個區域進行神經干細胞球的計數。

參照文獻［3］用Nestin熒光 免疫細胞 化學染色法對培養的細胞球進行鑒定。

1.3.4  Ad/EGFP體外轉染對神經干 細胞分化 的影響

對照組和轉染組的神經干細胞球在培養第7天時用10%FBS誘導分化，在第14天行免疫細胞化學反應，具體步驟參照文獻［4］。

每組任選3孔，每孔隨機選擇5個視野，相差顯微鏡下400倍視野計算細胞總數、β-Ⅲ tubulin和GFAP陽性細胞數，同時計算陽性細胞數占細胞總數的百分比；藉此區分 神經元 、星形膠質細胞，以鑒定轉染Ad/EGFP的NSCS的多分化潛能。

1.4  統計學處理

計量資料以x±s表示，用單因素方差分析及兩兩比較檢驗；計數資料應用χ2檢驗。數據應用SPSS10.0進行統計學處理。檢驗水準:α=0.05 。