(Tom Egil Hansen and Terje Johansen，BMC Biology，2011)
圖4 Vigene自噬雙標病毒載體圖譜
五．Vigene mCherry-GFP-LC3B 自噬雙標操作方法
（一）體外實驗
以2型AAV病毒為例，Vigene為您推薦的MOI值104-105，是根HEK293細胞得出的數據，不同的細胞所使用的病毒MOI值會有所不同。建議您感染目的細胞前，進行預實驗摸索最佳MOI值，推薦使用有熒光的對照病毒來摸索條件。
1. 為了節省病毒，推薦使用96孔板進行預實驗。
2. 將目的細胞接種于96孔板中，細胞融合率為50%為最佳。為保證細胞生長良好，請保證細胞貼壁過夜。
3. 取10ul AAV病毒原液加入90 ul培養基中做1:10稀釋（10-1），以此為起點做梯度稀釋直至稀釋10-7。可根據實際情況降低或提高稀釋倍數。
4. 取出提前準備好的96孔板，先確定細胞生長狀況是否良好。用準備好的病毒稀釋液替代舊培養基，注意保留未加入病毒的細胞孔作為對照組。
5. 在加入病毒稀釋液后，請在12-24h后觀察細胞狀態來確認加入的病毒量是否合適，是否因為加入的病毒量影響細胞狀態。如果細胞沒有變化，即所加病毒對細胞沒有毒性，可以繼續培養。
6. AAV病毒對細胞的感染較慢，請在感染細胞后每天觀察細胞中熒光表達情況。
另：如果您選擇的產品沒有熒光標簽請在96小時以后的不同時間段分別收獲細胞并通過Western-Blot或其他檢測手段來檢測基因表達。
注：由于AAV組織特異性，體外感染細胞的效率比較低，所以我們強烈推薦您購買AAV用于動物實驗。
（二）體內實驗
針對小鼠/大鼠來說，研究不同的方向有不同的AAV注射方法，詳情可查閱Vigene官網。
六．常見問題解答
1.重組AAV 安全嗎?
迄今為止，未發現野生型AAV有致病性。野生型AAV，在無需輔助病毒（如腺病毒）的存在下，復制效率非常低。重組腺相關病毒（rAAV）由多個質粒（cis質粒、輔助質粒、rep/Cap質粒）組成。Cis質粒、輔助質粒與rep/Cap質粒之間不具有同源性序列，因此重組AAV在理論上不具有復制的能力。
2.哪些血清型的 AAV 可供選擇？我該選用哪種AAV呢?
目前為您提供的AAV 血清型為AAV1，AAV2，AAV5，AAV7，AAV6，AAV8 & AAV9。請參閱下面指南中參考文獻的建議。
3.使用重組腺相關病毒rAAV傳遞基因的優勢是什么?請同時參閱轉染效率與不同細胞類型對照表，以確定哪種血清型AAV更適合您的細胞。
rAAV病毒滴度很高，可感染分裂和非分裂細胞、免疫原性極小、體內表達外源基因時間長。
4.AAV 載體穩定嗎? 如何保存AAV載體?
純化的AAV載體在4℃或更低溫度下高度穩定。建議您將AAV分裝后，-80℃下長期保存。
5.訂制AAV服務，客戶需要提供哪些材料? &客戶收到的產品是怎樣的?
您可以從我們的人源全長cDNA庫(17,000預制ORF)中挑選，或者提供您的質粒DNA或DNA序列，我們將基因克隆至AAV載體。您還可以指定特定的融合標簽和AAV血清型。
基因沉默服務，請您提供確切的shRNA的序列以構建重組rAAV載體。我們的標準載體具有U6啟動子和GFP標記。
通常情況下，可為客戶提供500 ul病毒液1×10^12 V.G. /mL。也可根據客戶的需要，提供特定體積和滴度的產品。
附：Vigene自噬雙標系統感染誘導自噬的HEK293細胞效果圖
