自噬雙標腺相關病毒說明（二）
(Tom Egil Hansen and Terje Johansen，BMC Biology，2011) 圖4 Vigene自噬雙標病毒載體圖譜五．Vigene mCherry-GFP-LC3B 自噬雙標操作方法（一）體外實驗以2型AAV病毒為例，Vigene為您推薦的MOI值104-105，是根HEK293細胞得出的數據，不同的細胞所使用的病毒MOI值會有所不同。建議您感染目的細胞前，進行預實驗摸索最佳MOI值，推薦使用有熒光的對照病毒來摸索條件。1. 為了節省病毒，推薦使用96孔板進行預實驗。2. 將目的細胞接種于96孔板中，細胞融合率為50%為最佳。為保證細胞生長良好，請保證細胞貼壁過夜。3. 取10ul AAV病毒原液加入90 ul培養基中做1:10稀釋（10-1），以此為起點做梯度稀釋直至稀釋10-7。可根據實際情況降低或提高稀釋倍數。4. 取出提前準備好的96孔板，先確定細胞......閱讀全文
自噬雙標腺相關病毒說明（二）
(Tom Egil Hansen and Terje Johansen，BMC Biology，2011)?圖4?Vigene自噬雙標病毒載體圖譜五．Vigene?mCherry-GFP-LC3B?自噬雙標操作方法（一）體外實驗以2型AAV病毒為例，Vigene為您推薦的MOI值104-105，是根
自噬雙標腺相關病毒說明（一）
一．關于自噬及LC31. 自噬大自噬（macroautophagy），也就是通常說的自噬（autophagy），是真核細胞蛋白降解的途徑之一。自噬可以被描述為細胞質內的成分（細胞器、蛋白等）被雙層膜的囊泡包裹，形成自噬體（autophagosome），進而傳遞到溶酶體進行降解的過程。詳細來說，自噬過
重組系統腺相關病毒產品說明
一．Cre-loxP重組系統作用原理Cre重組酶和loxP位點Cre重組酶（Cyclization Recombination Enzyme）由大腸桿菌噬菌體P1的Cre基因編碼，是由343個氨基酸組成的38kD的蛋白質。它不僅具有催化活性，而且與限制酶相似，能夠特異性識別loxP位點。LoxP（l
自噬信號通路相關MTOR
雷帕霉素（mTOR）的哺乳動物靶標，也稱為雷帕霉素和FK506結合蛋白12-雷帕霉素相關蛋白1（FRAP1）的機制靶標，是人類中由MTOR基因編碼的激酶。 mTOR是蛋白激酶的磷脂酰肌醇3-激酶相關激酶家族的成員。 mTOR與其他蛋白質結合，并作為兩種不同蛋白質復合物的核心成分，mTOR復合物1和m
自噬信號通路相關MYCN
這個基因是myc家族的一員，編碼一個具有基本螺旋-環-螺旋（bhlh）結構域的蛋白質。這種蛋白位于細胞核內，必須與另一種bhlh蛋白二聚以結合DNA。這種基因的擴增與多種腫瘤有關，尤其是神經母細胞瘤。該基因有多種編碼不同亞型的選擇性剪接轉錄變體。This gene is a member of th
細胞自噬研究詳解（二）
4、自噬流檢測方法細胞經自噬誘導或抑制后，需對自噬流的水平進行觀察和檢測，常用的技術手段見表1： 表1?自噬體計數及自噬流檢測方法匯總（Mizushima et al, Cell, 2010）其中，電鏡觀察法由于受到實驗條件和設備的限制應用范圍有限；而由于自噬過程發生快速，通過IB/WB檢測LC3-
病毒包裝技術——腺相關病毒(AAV)包裝（二）
2.3?蛋白質分析?為了分析AAV Rep和Cap蛋白質表達，按照2.2部分所述進行質粒轉染。轉染后48小時，將培養物刮到冷PBS/Mg(PBS含有5mM MgCl2)，細胞低速離心沉淀收獲。細胞沉淀在冰上用200ml STM-NP緩沖液(25mM蔗糖,10mM Tris-HCl，pH8
自噬受體蛋白招募自噬起始相關ULK復合物分子機制
Nat Comm 細胞自噬（Autophagy）是真核細胞中一種高度受調控的、溶酶體依賴的細胞代謝過程，對于維持細胞內穩態以及促進細胞的生長、發育和存活具有至關重要的作用。選擇性自噬通過自噬受體蛋白來特異性地識別和降解特定的底物，包括蛋白聚集體、受損線粒體、外源性的入侵病原體等。選擇性自噬在眾
自噬性死亡的自噬機制
細胞為維持正常新陳代謝，其生長過程始終都有自噬現象，這已在形態學中得到證實。但自噬的消長受多種因素影響，營養缺乏、胰高血糖素可誘導自噬，胰島素抑制自噬，細胞腫脹也同胰島素一樣有抑制自噬的作用，它們的作用點在于改變氨基酸的濃度。當氨基酸濃度降低時，自噬啟動可產生氨基酸，保證器官成活；相反則自噬被抑制。
自噬體的自噬發生條件
自噬體（autophgosome）自噬溶酶體（autolysosome）當自噬體與溶酶體融合后，形成自噬溶酶體。自噬性溶酶體是一種自體吞噬泡, 作用底物是內源性的,即細胞內的蛻變、破損的某些細胞器或局部細胞質。這種溶酶體廣泛存在于正常的細胞內，在細胞內起“清道夫”作用，作為細胞內細胞器和其它結構自然
自噬的自噬發生過程
在此過程中，自噬體的形成是關鍵，其直徑一般為 300 ~ 900 nm，平均 500 nm，囊泡內常見的包含物有胞質成分和某些細胞器如線粒體、內吞體、過氧化物酶體等。與其他細胞器相比，自噬體的半衰期很短，只有 8 min 左右，說明自噬是細胞對于環境變化的有效反應。由于自體吞噬較少受到關注,而且很難
自噬的自噬的研究方法
正常培養的細胞自噬活性很低，不適于觀察，因此，必須對自噬進行人工干預和調節，經報道的工具藥有：（一）自噬誘導劑1）Bredeldin A / Thapsigargin / Tunicamycin ：模擬內質網應激2）Carbamazepine/ L-690，330/ Lithium Chloride
腺相關病毒（AAV）技術快速入門手冊（二）
rAAV的局限性有哪些？1.體外實驗表達水平較低：主要是因為rAAV病毒的基因組是單鏈DNA，在體外環境形成雙鏈并轉錄翻譯外源基因的效率非常低。可以在體外水平感染rAAV病毒的同時感染輔助病毒比如Ad5型腺病毒或者終濃度10~50mM的丁酸鈉等方法提高細胞實驗的rAAV表達量。2.需較長時間開始表達
自噬信號通路相關PARP1
聚[ADP-核糖]聚合酶1（PARP-1）也稱為NAD + ADP-核糖基轉移酶1或聚[ADP-核糖]合酶1是人類中由PARP1基因編碼的酶。 它是PARP家族的酶之一。 PARP1的工作原理： · 通過聚ADP-核糖基化修飾核蛋白。 · 與BRCA一起發揮作用于雙鏈; PARP家庭的成員以單股行事
自噬信號通路相關KMT2A
該基因編碼一個轉錄輔激活子，在早期發育和造血過程中起到調節基因表達的重要作用。編碼蛋白包含多個保守功能域。其中一個域，即集合域，負責其組蛋白H3賴氨酸4（H3K4）甲基轉移酶活性，介導與表觀遺傳轉錄激活相關的染色質修飾。這種蛋白由酶Taspase 1加工成兩個片段，MLL-C和MLL-N。這些片段重
Autophagy（自噬）
自噬是近年來很熱門的領域，搜了一下園子，發現沒有這方面系統的介紹或討論，但很多戰友有這方面的疑問，加上本人最近對此也非常感興趣，因此，借本版來專門討論一下自噬（說實在的，自噬屬于丁香園哪一個版塊的范圍我也選不好），與各位同行或有志于研究自噬的戰友共同學習，也歡迎大家提出自己的看法，本人的目的就是交流
Autophagy（自噬）
自噬是近年來很熱門的領域，搜了一下園子，發現沒有這方面系統的介紹或討論，但很多戰友有這方面的疑問，加上本人最近對此也非常感興趣，因此，借本版來專門討論一下自噬（說實在的，自噬屬于丁香園哪一個版塊的范圍我也選不好），與各位同行或有志于研究自噬的戰友共同學習，也歡迎大家提出自己的看法，本人的目的就是交流
自噬分類
根據細胞物質運到溶酶體內的途徑不同，自噬分為以下幾種。①大自噬：由內質網來源的膜包繞待降解物形成自噬體，然后與溶酶體融合并降解其內容物；②小自噬：溶酶體的膜直接包裹長壽命蛋白等，并在溶酶體內降解；③分子伴侶介導的自噬（CMA）：胞質內蛋白結合到分子伴侶后被轉運到溶酶體腔中，然后被溶酶體酶消化。CMA
關于細胞自噬的自噬形式的介紹
細胞自噬主要有三種形式：微自噬（microautophagy)、巨自噬（macroautophagy）和 分子伴侶介導的自噬 (Chaperone-mediated autophagy，CMA）。 微自噬 定義 ：指 溶酶體或者液泡內膜直接內陷底物包裹并降解的過程。 作用時間：多在種子成熟
與自噬信號通路相關因子介紹MTOR
雷帕霉素（mTOR）的哺乳動物靶標，也稱為雷帕霉素和FK506結合蛋白12-雷帕霉素相關蛋白1（FRAP1）的機制靶標，是人類中由MTOR基因編碼的激酶。 mTOR是蛋白激酶的磷脂酰肌醇3-激酶相關激酶家族的成員。 mTOR與其他蛋白質結合，并作為兩種不同蛋白質復合物的核心成分，mTOR復合物1和m
與自噬信號通路相關因子介紹MYCn
這個基因是myc家族的一員，編碼一個具有基本螺旋-環-螺旋（bhlh）結構域的蛋白質。這種蛋白位于細胞核內，必須與另一種bhlh蛋白二聚以結合DNA。這種基因的擴增與多種腫瘤有關，尤其是神經母細胞瘤。該基因有多種編碼不同亞型的選擇性剪接轉錄變體。This gene is a member of th
自噬相關蛋白LC3是什么
LC3是自噬標志物，自噬形成時，胞漿型LC3（即LC3-I）會酶解掉一小段多肽，轉變為（自噬體）膜型（即LC3-II），LC3-II/I比值的大小可估計自噬水平的高低。pro-LC3；立刻C末端被ATG4水解切割掉一段多肽，暴露甘氨酸，這個是LC3-I，胞漿分布。自噬過程中，LC3-I在ATG7和A
實驗中常用的自噬檢測方法（二）
(1) 氯喹 ? ( Chloroquine ，CQ) 處理，檢測自噬流中 LC3B-II 變化在酸性溶酶體中，氯喹會使溶酶體 pH 值升高，使溶酶體中酸性水解酶失活?，從而抑制細胞內自噬溶酶體的融合與降解。氯喹處理細胞會導致 LC3B-II 的聚集，此時觀察到的 LC3B-II 的變化僅代表自
什么是腺相關病毒？
腺相關病毒（adeno-associated virus，AAV）,也稱腺伴隨病毒,屬于微小病毒科依賴病毒屬,是目前發現的一類結構最簡單的單鏈DNA缺陷型病毒，需要輔助病毒（通常為腺病毒）參與復制。它編碼兩個末端的反向重復序列（ITR）中的cap和rep基因。ITRs對于病毒的復制和包裝具有決定
腺相關病毒的簡介
腺相關病毒（adeno-associated virus，AAV）,也稱腺伴隨病毒,屬于微小病毒科依賴病毒屬,是目前發現的一類結構最簡單的單鏈DNA缺陷型病毒，需要輔助病毒（通常為腺病毒）參與復制。它編碼兩個末端的反向重復序列（ITR）中的cap和rep基因。ITRs對于病毒的復制和包裝具有決定性作
什么是自噬？
自噬是溶酶體吞噬細胞器和其他內容物以清除不必要或功能失調的成分的過程。該關鍵機制允許細胞材料的系統降解和回收。它可以依據不同的環境促進細胞存活或細胞死亡。
細胞自噬工具
就像我們會打掃以保持房間整潔一樣，細胞也演化出了一系列“清潔”機制，來維持有序的生命活動。自噬（autophage）就是其中最重要的機制之一。自噬于上個世紀60年代被發現，但引起科學界的廣泛關注，還是在1990年代日本科學家大隅良典（Yoshinori Ohsumi）做的相關研究。大隅良典也因此獲得
細胞自噬過程
a、吞噬泡噬過程存在于膜的形態變化，體現了膜的流動性特點，a正確；b、線粒體是有氧呼吸的場所，氧氣在線粒體中被消耗，線粒體功能退化，氧氣的消耗量減少，b正確；c、細胞及時清除受損的線粒體，維持了細胞內部環境的相對穩定，c正確；d、當細胞養分不足時，細胞“自噬作用”一般都會增強，為細胞提供更多的養分，
細胞自噬現象
細胞自噬（autophagy）的過程（以下有視頻講解）1）細胞接受自噬誘導信號后，在胞漿的某處形成一個小的類似"脂質體"樣的膜結構，然后不斷擴張，被稱為Phagophore。2）Phagophore不斷延伸，將胞漿中的任何成分，全部攬入，然后"收口"，成為密閉的球狀的autophagosome，即"
細胞自噬過程
細胞自噬(autophagy)是真核生物中進化保守的對細胞內物質進行周轉的重要過程。該過程中一些損壞的蛋白或細胞器被雙層膜結構的自噬小泡包裹后，送入溶酶體(動物）或液泡（酵母和植物 ）中進行降解并得以循環利用。