自噬的自噬的研究方法

正常培養的細胞自噬活性很低，不適于觀察，因此，必須對自噬進行人工干預和調節，經報道的工具藥有：
（一）自噬誘導劑
1）Bredeldin A / Thapsigargin / Tunicamycin ：模擬內質網應激
2）Carbamazepine/ L-690，330/ Lithium Chloride（氯化鋰）：IMPase 抑制劑（即Inositol monophosphatase，肌醇單磷酸酶）
3）Earle's平衡鹽溶液：制造饑餓
4）N-Acetyl-D-sphingosine（C2-ceramide）：Class I PI3K Pathway抑制劑
5）Rapamycin：mTOR抑制劑 (最常用)
6）Xestospongin B/C：IP3R阻滯劑
（二）自噬抑制劑
1）3-Methyladenine（3-MA）：（Class III PI3K） hVps34 抑制劑
2）Bafilomycin A1：質子泵抑制劑
3）Hydroxychloroquine（羥氯喹）
除了選用上述工具藥外，一般還需結合遺傳學技術對自噬相關基因進行干預：包括反義RNA干擾技術（Knockdown）、突變株篩選、外源基因導入等。
（三）自噬檢測方法：
細胞經誘導或抑制后，需對自噬過程進行觀察和檢測，常用的策略和技術有：
1）Western Blot檢測LC3的切割
利用Western Blot檢測LC3-II/I比值的變化以評價自噬形成。自噬形成時，胞漿型LC3會酶解掉一小段多肽形成LC3-I，LC3-I跟PE結合轉變為（自噬體）膜型（即LC3-II），因此，LC3-II/I比值的大小可估計自噬水平的高低。

2）在熒光顯微鏡下采用GFP-LC3單熒光體系/mRFP-GFP-LC3雙熒光體系等融合蛋白來示蹤自噬形成：
GFP-LC3 單熒光自噬指示體系：
利用LC3在自噬形成過程中發生聚集的原理，開發出GFP-LC3指示技術：無自噬時，GFP-LC3融合蛋白彌散在胞漿中；自噬形成時，GFP-LC3融合蛋白轉位至自噬體膜，在熒光顯微鏡下形成多個明亮的綠色熒光斑點，一個斑點相當于一個自噬體，可以通過計數來評價自噬活性的高低。但是綠色斑點增多并不一定代表自噬活性增強，也有可能是自噬溶酶體降解途徑受阻，可以通過western blot 檢測游離的GFP、p62來驗證。
另一種方法是利用mRFP-GFP-LC3 。
mRFP-GFP-LC3 雙熒光自噬指示體系：
由于分子生物學的發展，現在已經誕生了mRFP-GFP-LC3 雙熒光自噬指示體系，用于標記及追蹤LC3以及自噬流的變化。其中GFP是酸敏感型GFP蛋白，而mRFP是穩定的熒光表達基團，不受外界影響。由于自噬小體進入第二階段后，與溶酶體進行融合，形成自噬溶酶體。自噬溶酶體由于溶酶體內部的酸性環境，可以導致PH下降，GFP淬滅，因此，GFP的減弱可指示自噬溶酶體形成的順利程度，GFP越少，則從自噬小體到自噬溶酶體階段流通得越順暢。反之，自噬小體和溶酶體融合被抑制，自噬溶酶體進程受阻。mRFP是一直穩定表達的，因而可以通過GFP與mRFP的亮點比例來評價自噬流進程。

mRFP-GFP-LC3 雙熒光自噬指示體系的出現，把自噬研究帶入了一個新的階段，自噬不再只是指標，而是一種機制，自噬流的順暢與否，對于細胞生理功能的穩定非常關鍵。

3）透射電鏡下觀察自噬體的形成：
自噬經歷了：吞噬泡(phagophore)--自噬小體(autophagosome)--自噬溶酶體(autolysosome)
透射電鏡下吞噬泡(phagophore)的特征為：新月狀或杯狀，雙層或多層膜，有包繞胞漿成分的趨勢。自噬小體(autophagosome)的特征為：雙層或多層膜的液泡狀結構，內含胞漿成分，如線粒體、內質網、核糖體等。自噬溶酶體(autolysosome)的特征為：單層膜，胞漿成分已降解。