| 實驗方法原理 | 在無抗生素情況下，至少將細胞培養一周，將培養上清轉移至處于對數生長早期的指示細胞中，孵育 3~5d ，將細胞固定和染色，尋找細胞核之外的熒光。 |
|---|---|
| 實驗材料 | 來自于7天單層培養的無抗生素的細胞培養上清液或經離心后的上清液 指示細胞 |
| 試劑、試劑盒 | Hoechst 33258 染料 BSS-PR D-PBSA 去離子水 固定劑 封固劑 |
| 儀器、耗材 | 培養皿 |
| 實驗步驟 | 1. 將指示細胞（如 3T6，NRK，Vero，A549）接種于培養皿（6 cm 直徑）中，不要使用抗生素，接種的細胞數可以在 4~5 天產生 50%~60% 的匯合層就足夠了（如 2×104 NRK或 1×105 A549 在 5 ml 培養液中）。 2. 加入來自所測試培養物的 1.5 ml 培養液。 3. 將上述培養物進行孵育直至細胞達到 50%~60% 匯合。 4. 移去培養液，并廢棄之。 5. 用 BSS-PR （無酚紅的 Hanks’BSS）或 D-PBSA （無 Ca2+，Mg2+ 的 Dulbecco’sPBSA）沖洗單層培養物，將沖洗液廢棄。 6. 加入新鮮 BSS-PR 或 D-PBSA 按 50：50 的比例用固定液（新鮮制備的冰醋酸：甲醇（1：3，置冰上））稀釋，沖洗單層培養物，廢棄沖洗液。 7. 加入純固定液，沖洗，廢棄沖洗液。 8. 加入更多固定液（約 0.5 ml/cm2），固定 10 min。 9. 移去固定液，并將固定液廢棄。 10. 如果準備貯存，則將單層培養物完全干燥（可在這個階段積累標本，以后再染色）。 11. 如果你要直接進行染色，可用去離子水沖洗，并廢棄沖洗液。 12. 在 BSS-PR 或 D-PBSA 溶液中加入 Hoechet 33258（Hoechst 33258 染料，50 ng/ml 溶于未加入酚紅的 BSS （BSS-PR）或 D-PBSA），在室溫下染色 10 min 。 13. 移去染色液，并將其廢棄。 14. 用水沖洗單層培養物，廢棄沖洗液。 15. 加一滴封固劑（緩沖液配制的甘油溶液）封固蓋玻片，擦去來自蓋玻片邊緣的多余封固劑。 16. 用 330/380 nm 激光濾片和 LP 440 nm 屏障濾片，對單層培養物進行熒光檢査。 |
| 注意事項 | 如果培養物在測定結束前達到完全匯合， 染色將被抑制， 支原體的觀察很困難。 |
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