藥物所等揭示促腎上腺皮質激素釋放因子受體的激活機制

　　促腎上腺皮質激素釋放因子受體(Corticotropin-Releasing Factor Receptors) CRF1R和CRF2R是B類GPCR的重要成員，在中樞和外周神經系統中廣泛表達，主要通過偶聯下游Gs蛋白參與體內內分泌系統、行為系統和免疫系統的壓力應答。研究表明，CRF1R可能與壓力導致的酗酒和藥物濫用相關。CRF1R和CRF2R在體內被內源性配體CRF和UCN1-3 (urocotins 1-3)激活。CRF初次在羊下丘腦中被發現，能促進促腎上腺皮質激素（Adrenocorticotropic hormone, ACTH）的釋放從而在下丘腦-垂體-腎上腺軸（Hypothalamic–pituitary–adrenal, HPA）中發揮關鍵作用。與UCN1對CRF1R和CRF2R都有高親和力不同，CRF對CRF1R的親和力明顯高于CRF2R，而UCN2和UCN3則表現出了CRF2R選擇性激動劑的特性。

　　中國科學院上海藥物研究所徐華強課題組和浙江大學基礎醫學院張巖課題組合作，依托浙江大學冷凍電鏡中心，解析了CRF1R和CRF2R兩個亞型在內源性配體UCN1激活下與Gs蛋白三聚體復合物的三維結構。研究成果為針對壓力應答、焦慮、抑郁和心腦血管疾病的藥物研發提供了結構基礎。研究論文Molecular Basis for Hormone Recognition and Activation of Corticotropin-Releasing Factor Receptors于1月30日在線發表于Molecular Cell。

　　該三維結構清晰地揭示了CRF受體特異性識別并結合UCN1的分子機制和招募下游效應蛋白Gs蛋白發揮生理功能的結構基礎。相比于其他B類GPCR的多肽配體，UCN1具有獨特的結構特征：UCN1的N端7個氨基酸后折形成環狀，隨后的33個氨基酸以一個長α螺旋的形式垂直插入受體跨膜區，其中配體的C端結合受體的胞外區，配體的N端結合受體的跨膜區。

　　在同期雜志上，徐華強與張巖還和莫納什大學教授Patrick M. Sexton與Denise Wootten團隊合作，以背靠背的形式發表了CRF-CRF1R-Gs復合物的冷凍電鏡結構。將兩篇文章中報道的三個CRF受體激活態結構進行對比后發現，CRF多肽和CRF2R的表面有較多的負電荷，而CRF1R的表面正電荷居多，這也從結構方面解釋了為什么CRF對CRF1R具有更高的親和力。

　　B類GPCR正確發揮生理功能需要精確的配體識別，但這一調控過程的具體機制仍不清楚。該工作成果結合之前報道的多個B類GPCR激活態結構，為系統分析歸納總結該家族受體與配體相互作用機制提供了良好契機。目前已經獲得結構解析的B類GPCR有：胰高血糖素樣肽1受體GLP1R、降鈣素受體CTR和人源甲狀旁腺激素受體1型PTH1R。其中前兩者是世界上首次報道的GPCR信號轉導復合物冷凍電鏡結構；后者也同樣是由徐華強課題組和張巖課題組聯合其他實驗室攻關完成。對以上結構進行比較發現，結合配體C端的胞外區呈現出了最大的構象差異，結合配體N端的跨膜區盡管宏觀上沒有顯著區別，但配體結合口袋的形狀大小和組成該口袋的氨基酸因受體而異。依據配體小肽在結合口袋的結構可將B類GPCR家族的多肽配體分為CRF樣肽、降鈣素樣肽、胰高血糖素樣肽三類。因此B類GPCR精確的配體識別主要分兩步進行，第一步是受體胞外區快速識別配體C端，隨后配體N端深入結合受體跨膜區，這也是決定配體特異性的關鍵一步。這種兩步識別的模式阻止了B類GPCR錯誤識別配體的發生。

　　通過與已解析的失活態的CRF1R跨膜區結構（PDB:4K5Y）比較發現，CRF1R被激活后構象變化主要集中在TM5、TM6、TM7，其中TM6在P3216.47b -G3246.50b處解螺旋并形成一個90°的扭曲，該變化被N2835.50b 和Q3557.49b之間的氫鍵所穩定，從而為招募Gs蛋白提供足夠的空間。受體的跨膜螺旋與Gαs的α5螺旋的相互作用和受體的Helix 8螺旋與Gβ1的N端的相互作用是受體與Gs蛋白的主要作用界面。這種在B 類GPCR中高度保守的“NPGQ”氨基酸和與Gs的作用界面，進一步揭示了B類GPCR被激活的普遍機制。

　　和研究團隊此前解析的長效激活狀態的PTH1R信號轉導復合物類似，在UCN1-CRF1R/CRF2R-Gs復合物受體跨膜區周圍，研究人員也發現了許多有序排列的脂質和膽固醇分子，在Gαs 和 Gβγ 亞基中發現了脂修飾部分。為研究這些脂質分子對膜蛋白的作用，研究人員選擇了兩個與電子密度高度吻合且在三個結構中相對保守的膽固醇分子，發現作用于這兩個膽固醇分子的氨基酸不僅在B類GPCR中高度保守，而且被突變后CRF1R和CRF2R與配體CRF和UCN1的親和力大大降低，這證明脂質在穩定膜蛋白和與配體的識別中發揮重要作用。

　　該研究解析了全激活狀態的促腎上腺皮質激素釋放因子受體CRF1R、CRF2R與Gs蛋白三聚體的結構，揭示了配體識別的特異性，闡明了B類GPCR激活的普遍機制，并為進一步研究膜蛋白和脂質之間的相互作用和靶向CRF1R、CRF2R的合理藥物設計提供了詳細的結構信息。

　　上海藥物所博士研究生馬山山、浙江大學博士后沈慶亞、上海藥物所副研究員趙麗華為該論文的共同第一作者。徐華強、張巖和趙麗華為共同通訊作者。兩個研究團隊緊密協作，長期致力于B類 GPCR 的結構和功能研究。該項工作獲得中科院青年創新促進會、上海市科學技術委員會以及國家自然科學基金委員會的資助。

圖1：促腎上腺皮質激素釋放因子受體與配體的結合特異性和受體與Gs蛋白復合物的冷凍電鏡結構。

圖2：CRF1R與CRF2R復合物結構中的膽固醇分子。