菌落的裂解和DNA與濾膜的結合實驗

帶有 E.coli 轉化子克隆的濾膜

變性液中和液SDS (10%m V)2X SSPE

玻璃或塑料托盤微波爐濾紙

一、材料

1. 緩沖液和溶劑

變性液，中和液，SDS (10%, m/V)，2X SSPE。

2. 專用設備

(1) 處理濾膜用的玻璃或塑料托盤。

餐館用的托盤就很理想，一次可操作直徑 9?10 cm 大小的 25 張濾膜。

(2) 微波爐，真空烤干箱（可達 80℃）或紫外交聯裝置。

(3) Whatman 3 MM 濾紙。

3. 載體和菌種

帶有 E.coli 轉化子克隆的濾膜。

二、方法

1. 將 Whatman 3 MM 濾紙（或相當的濾紙）切成大小和形狀適當的 4 張。使之適于 4 個玻璃或塑料托盤的底部，將 4 張 3 MM 濾紙分別浸泡在下列 4 種液體：
10% SDS，變性液，中和液，2X SSPE。

2. 傾去多余的液體，用一根 10 ml 移液管滾壓濾紙，以除去濾紙與托盤底部間的氣泡。

如濾紙太濕，溶解過程中細菌克隆將會腫脹和擴敗，致使雜交信號摸糊和減弱，給以雜交信號為依據進行克隆鑒定的工作造成很大困難。

3. 用鈍口鑷子揭下瓊脂板上的硝酸纖維膜或尼龍膜，菌落面向上置于 SDS 浸濕的 3 MM 濾紙上，3 min。

此項處理可防止變性和中和過程中質粒 DNA 的擴散，從而給出更加清晰的雜交信號。

4. 第一張濾膜在 SDS 溶液中浸泡 3 min 后，將其轉到用變性液浸濕的第二張濾膜上，其余從瓊脂板上揭下的濾膜也以同樣次序進行轉移，每張濾膜都要在變性液中浸泡 5 min。

在將濾膜從一個托盤移向另一個托盤時，用第一個托盤的邊緣盡可能將濾膜上的水去掉，也可將濾膜先移至到紙巾上以去除多余水分。要避免讓液體留在濾膜上帶有細菌克隆的地方。

5. 將濾膜轉到已經在中和液中浸泡的第三張 3 MM 濾紙上，并浸泡 5 min。

選用，重復此步驟一次。

6. 將濾再膜轉到已經在 2X SSPE 液中浸泡的最后一張 3 MM 濾紙上，并浸泡 5 min。

我們寧愿用一定體積的 2X SSPE 液充滿托盤或浴盆（如在雜交后洗膜時將要用到的），然后使來自步驟 5 的濾膜浮在液體表面數分鐘，此后，在晃動容器的過程中讓濾膜沉入液面以下并留在液體中，直到最后一張濾膜用同樣方法處理完畢。這樣做有兩個目的：洗凈濾膜的中和液，使濾膜帶上 EDTA 以螯合二價陽離子（如 Mg²⁺），從而抑制任何殘留的可降解 DNA 的核酸酶活性。

7. 用以下方法之一干燥濾膜：

如用烤干法固定 DNA：將濾膜置于干的 3 MM 濾紙上，菌落面向上，于室溫至少 30 min。

如用紫外交聯法固定 DNA：按銷售商推薦方法，將濾膜置于已用 2X SSPE 液浸泡過或干的 3 MM 濾紙上。

8. 用以下方法之一固定 DNA 于濾膜上：

烤干法：用兩張 3 MM 濾紙上下包夾濾膜，在真空烤箱內 80℃ 烤干 1~2 h 固定 DNA。

過度烤干會使濾膜變得很脆弱。尚未完全中和的硝酸纖維膜在烤干時會變為黃色或棕色，很容易破碎，也會使非特異雜交所形成的背景明顯增強。

紫外交聯法：用紫外交聯裝置按銷售商推薦方法固定 DNA。

9. 用標記探針與固定在濾膜上的 DNA 進行雜交。

所有在雜交反應中不被馬上使用的濾膜，都應加在 3 MM 濾紙中，并用鋁箔包好于室溫存放。