葡萄組織培養

一、葡萄的形態特征和生物學特性
葡萄（Vitis　vinifera　L．）屬落葉木質藤本植物，葡萄地上部分的莖細長柔弱，髓部較大，組織較疏松。節上具有卷須，使新梢可以纏繞其它樹木或支架上向上攀援。葉近圓形或卵形，35裂，基部心形。圓錐花序。葡萄是深根性作物，其根系在土壤中的分布狀況，隨氣候、土壤型，地下水位、栽培管理方法的不同而發生變化。但在大多數情況下，根系垂直分布最密集的范圍，是在20～80 cm的深度內，但在不同的栽培管理條件下，根系的分布也將隨著發生變化。
葡萄的根富于肉質，髓射線發達，能貯藏大量的有機營養物質，如糖、蛋白質和單寧等。葡萄的枝蔓上很容易產生不定根，故在生產上多采用扦插法繁殖。在大氣潮濕的情況下，枝蔓上往往長出氣生根。

葡萄原產于溫帶地區，不太抗寒。葡萄的根系抗寒力很弱，大部分歐洲種葡萄的根系在－5～－7℃時即受凍，某些美洲種能忍受－11～－12℃左右的低溫。
葡萄在全世界的果品生產中，產量及栽培面積一直居于首位。其果實除作為鮮果食用外，主要用于釀酒，還可制成葡萄汁、葡萄干和罐頭等加工品。葡萄不僅味美可口，而且營養價值較高。成熟的漿果中含有15～25％的葡萄糖和果糖以及多種對人體有益的礦物質和維生素。
二、葡萄的組織培養－莖尖的分化與生長
（一）分離接種
從田間生長旺盛的葡萄新梢頂端取1～2cm的莖尖。除去幼葉后在5%次氯酸鈉溶液中浸泡2～3分鐘，消毒滅菌，以后用無菌水沖洗3次，再在0．1%升汞溶液中浸泡約2min，以后用無菌水沖洗四次。在無菌條件下分離出約2mm長的莖尖，接種到培養基上。
（二）培養基
葡萄莖尖分化培養基以MS培養基（無機鹽減半為好），再添加BA1～2，NAA0．01，LH100，蔗糖2%，瓊脂0．6%，而B5培養基愈傷組織化嚴重，莖尖生長不好。（三）莖尖的分化
葡萄1～2mm莖尖接種后成活率皆較高（表12－1），只有法國蘭品種為56．4%，白雅等品種皆在72．6%以上，而友誼、白雅等品種的成活率達到百分之百。
表12－1　葡萄莖尖接種成活率

 接種成活的莖尖一個月左右開始分化幼葉和側芽，兩個月左右，由于側芽的不斷增生，形成芽叢。由于不同品種對BA和NAA的反應不同，故生長有明顯區別，巨峰、大粒白香蕉、赤霞珠等品種，由于頂端優勢強，側芽生長勢弱，故增殖率低，但成苗率高；白羽、白雅、白謝希、貴人香等大多數品種側芽分生能力強，可在幼莖上多次分枝，故成苗率低；2號大白粒等個別品種，則幼莖短縮膨大呈球形，很難成苗。
（四）莖尖苗的生長
在莖尖分化培養中產生的成苗率低和成苗困難，密集生長的芽叢，可將分化培養基中的BA濃度減低至0．5，同時添加GA30．2，則經一個月的培養，就可長成2～3cm高的幼莖。此外黑暗處理對幼莖的伸成，提高成苗率，也有明顯的效果。
表12－2　黑暗處理對葡萄白羽品種芽叢成苗的影響

  （五）生根與移栽
切取2～3cm長的莖尖苗，接種到MS+ IAA0 ．4+NAA0．05培養基中，進行生根培養，其中添加和瓊脂0．4%，1～2周后幼苗開始生根，一個月形成完整的根系，同時具備5～6片新葉，生根率一般在90%以上。
移栽時洗去根上的培養基，栽到蛭石內，使根系具良好的通氣條件，種后蓋上塑料薄膜，經7～10d鍛煉適應后可去掉，移栽成活率也達90%左右。

（六）注意事項　提高葡萄試管苗移栽成活率要注意：①幼苗生長要健壯；②要保持空氣濕度；③根際通氣要良好；④要盡量減少雜菌污染；⑤澆灌的溶液濃度不能過高。
三、葡萄無病毒苗的培養(Culture of Disinfected Seedling)
（一）培育意義
葡萄受到26種病毒的危害。由于病毒的危害，葡萄的長勢減弱，產量降低，果實的糖分含量減少，風味變劣。葡萄卷葉病是危害最大的病毒病，在不同品種上表現不同，但多數葉片變紅，自基部起向內卷，似革質增厚，粗糙易脆；有的葉脈綠色，葉肉黃色；有的品種則表現矮化。此病可減產10～50%，造成果實糖分含量降低，成熟期推遲兩周，紫葡萄果色會變綠。
現在已廣泛應用莖尖組織培養和熱處理結合的方法來培育園藝植物無病毒苗。而葡萄的莖尖培養脫毒利用還不十分普遍，這是因為葡萄也可通過簡易的熱處理法來得到無病毒植株。但莖尖脫毒的方法也兼有短期大量快速繁殖的作用，所以應用上具有很大的意義。
（二）熱處理脫毒
熱處理可以有不同的方法：
1．葡萄無性系處理材料置于38℃，CO21200ppm的人工氣候箱內。經30min處理，較易從枝條尖端或休眠芽中除去扇葉病毒。卷葉病毒則處理3個月或更長時間也難以除去。黃點病毒處理11個月也無效。
2．將感染材料的休眠芽插入健康指示植物的蔓中，然后在38℃的環境中保持兩個月，以后取出枝條和接種芽繼續生長。
3．直接將葡萄蔓浸泡在50℃的溫水中10～20min，可以治療皮爾斯病，但不能治療黃點病及卷葉病。
（三）組織培養脫毒技術
莖尖組織培養脫毒要經過七個時期：A為莖尖接種后的變綠增大期；B為形成畸形葉期；C為形成許多芽和芽的伸長期；D為許多芽展開小葉和小葉伸長期；E為誘導發根期；F為地上部和地下部的伸長期；G為上盆期。
圖12－1　莖尖脫毒培養各期生長示意圖
1．莖尖接種后變綠、增大期的培養
從被病毒感染的植株上取材，在5℃下冷藏保存。以后在25℃，相對濕度80%，16h的長日照條件下水培。再從長出的新芽經消毒后切取莖尖進行培養，大小約0.2～0.3mm（帶一個葉原基）。
以MS培養基作基本培養基，不能添加GA3，否則培養的莖尖大部分黃化，生成膨軟的組織，一轉移就完全損失。試驗結果以1/2MS，添加NAA0．1，BA1．0，KT0．5，腺嘌呤4．0，蔗糖30g/L，瓊脂6．0，pH5．8為好。培養的莖尖的率最低，僅13．3%，1mm以上能生長的個體也最多，達88．6%。
2．從A到D（莖葉伸長期）
處于變綠、增大期的莖尖如繼續在上述培養基進行繼代培養。不僅不生長，最后還會枯死。據研究，只要將原來培養基中的NAA0．1，改換為IAA0．2，即采用1/2MS，添加IAA0．2，BA1．0, KT0．5，腺嘌呤4．0，蔗糖30克/升的培養基。則有34．1%的莖尖可生長到達畸形葉期（B期）。
在上述培養基對從 B期到較多芽的形成及伸長期（C期），同樣是適合的，有 76．7％的莖尖可生長到C期。從 C期到莖葉伸長期（D期）則應將上述培養基中的BA和蔗糖濃度各降低一半，即采用1/2MS，添加IAA0．2mg/L，BA0．5 mg/ L，KT0．5 mg/ L，腺嘌呤4 mg/ L ，蔗糖 15g／L的培養基。有 94．4％莖尖的莖葉皆能很好生長。
3．從D期到地上和地下部的生長期（F期）
為誘導生根，將2cm左右的芽切下，轉入 Galzy（1964）培養基，添加 NAA0．1 mg/L，經60天的生長，發根率可達89．8％，而地上部也進行生長的只占10．2％。為促進地上部也同時進行生長，在誘根培養20天，根長0．5cm米左右時轉入無激素的Galzy （1964）培養基，則有 73．7％的植株地上和地下都可以同時生長，經1個月培養，地上都可達4～5cm，葉數可達5片左右。
4．從F期到上盆（G期）
從培養瓶中取出苗時要注意絕對不要傷根，將瓊脂沖洗掉，以后種在以蛭石為基質，直徑6 cm的塑料盒中。栽培在溫度15～25℃，光照強度3000Lx，光照時間為一天16h，相對濕度80％的鍛煉室中進行。約培育20天，地上部開始伸長，發綠，則可移至通常的溫室中進行隔離栽培。
5．無病毒苗的大量繁殖
處于D期的材料，莖葉常集中在一起，成為叢狀，可以一個個進行分離，再接種到1／2MS，添加 IAA0．2 mg/ L ，BA1 mg/ L，KT0．6mg/ L ，腺嘌呤 4mg/ L，蔗糖 15g／L的培養基，即能形成大量新芽，以后轉入上述培養基中只BA減為0．5 mg/ L 的培養基，即可使小葉展開、伸長，得到植株。這樣反復繼代培養，可繁殖得到大量的無病毒苗。