薄層色譜法(thinlayerchromatography，TLC)

一、目的要求
1. 了解薄層層析分離和鑒定有機物的原理和方法；
2. 掌握薄層層析分離和鑒定有機物的操作步驟。
二、基本原理
薄層色譜具有設備簡單、速度快、分離效果好、靈敏度高以及能使用腐蝕性顯色劑等優點，是一種微量的分離分析方法。它可以與光譜或質譜結合起來，是一種很有發展前途的分析技術。
薄層色譜是把吸附劑或支持物（如氧化鋁、硅膠和纖維素粉等）均勻地鋪在一塊玻璃板上形成薄層，將分離樣品滴加在薄層的一端，當流動相沿著含有固定相的支持物上移動時，被分離組分就在固定相與流動相之間進行分配或吸附，經過反復無數次的分配平衡或吸附平衡，最后按照各個組分的差異而被分離。
三、基本操作
薄層色譜中，鋪薄層的板可用玻璃板，也可用塑料板。鋪在板上的吸附劑（或支持物）可分為加粘合劑的硬板和不加粘合劑的軟板。薄層色譜技術包括制板、點樣、展開、顯色等步驟。現分述如下：
1. 薄層板的制備
薄層板制備的好壞直接影響色譜的結果，薄層應盡量鋪得均勻，厚度在0.25～0.5mm之間。
硅膠和氧化鋁的粘性差，使用前必須加粘合劑。市售的硅膠G 和氧化鋁G 均已含有粘合劑半水石膏，可直接加入水調勻后鋪層。

（a）1-玻璃板； 2-厚度墊板； 3-吸附劑； 4-有機玻璃尺
（b）1-玻璃板； 2-玻璃條； 3-有機玻璃尺； 4-吸附劑
（c）1-玻璃板； 2-玻璃棒； 3-控制厚度的金屬絲； 4-吸附劑
圖2.55 薄層板涂布法
薄層的涂布有傾斜法和平鋪法等多種方法。傾斜法是將調勻的糊狀物倒在玻璃板上，用手搖晃，使其表面均勻光滑，然后靜置固化。平鋪法是將調勻的糊狀物，倒在玻璃板的一端，用一根均勻的玻璃棒（直徑0.6～0.8cm），兩端各繞一根不銹鋼細絲（0.2～0.3mm）或鎳鉻絲，將糊狀物均勻平鋪，即可涂布成均勻的一層。涂布的時間、推移的速度力求均勻一致，最好一次推移完畢，不宜來回操作，如（圖2.55c）。按上述方法涂好板后，靜置讓其固化晾干。
經室溫干燥的薄層還要活化，所謂“活化”就是在高溫除去水分，硅膠薄層和纖維薄層要在110℃下干燥1 小時，氧化鋁薄層在80℃烘烤半小時，聚酰胺薄層要在110℃下干燥5min。活化后的薄層應放在干燥器內保存。
2. 點樣
用毛細管或微量注射器取樣品溶液，在上述制好的薄層板一端約1.5cm 處，，垂直地輕輕地接觸到薄層上的吸附劑，樣品溶液就可靠到薄層上。應分次點下，不可一次點得太多，不然樣品點直徑太大，樣點直徑一般以2～4mm 為宜。在定性和定量分析時，同一薄層上的樣點直徑應一致。
3. 展開
薄層的展開需要在密閉的器皿（如色譜缸、標本缸等）中進行，如圖2.56。用來展開樣品中各組分的溶劑（流動相）稱展開劑。先將展開劑放在色譜缸中，蓋上缸蓋，讓缸內溶劑蒸氣飽和5～10min。再將點好試樣的薄層板樣點一端朝下放入缸內（切勿使樣點浸入溶劑中），蓋好缸蓋，展開劑因毛細管效應而沿薄層上升，樣品中組分隨展開劑在薄層中以不同的速度自下而上移動而導致分離。當展開劑前沿上升到樣點上方10～15cm時取出薄層板，放平，標明溶劑前沿位置，用電吹風冷風吹走溶劑。
4. 顯色
經上述展開完畢并趕走溶劑的薄層板上分離的化合物本身有顏色時，可直接觀察其斑點。若本身無色可先在紫外燈下觀察有無熒光斑點，也可用顯色劑噴霧顯色。
5. 比移值（Rf值）
在固定的條件下（吸附劑、溫度、展開劑等），不同化合物如甲和乙在薄層上以不同的速度移動，當停止展開后，各組分的色斑在薄層上的位置可用尺來測量，以比移值（Rf值）表示，如圖2.57所示。

化合物甲的Rf 值 = a/c
化合物乙的Rf值 = b/c
最理想的Rf值為0.4～0.5，良好的分離Rf值為0.15～0.75，如果Rf值小于 0.15或大于0.75則分離不好，就要調換展開劑重新展開。
一種物質在固定的條件下有固定的Rf值，不同物質在相同的條件下可有不同的Rf值。因此，未知物與已知物（標準物質）在相同條件下進行展開比較Rf值可提供定性依據。
四、儀器藥品
層析缸、玻璃研缽、層析玻璃板（5×20cm）、微晶纖維素粉、毛細管、噴霧器等氨基酸標準樣品溶液、氨基酸溶液（紅圓珠筆油乙醇溶液、 藍圓珠筆油乙醇溶液）展開劑：正丁醇∶冰醋酸∶水=2 ∶1∶1
顯色劑：0.5% 茚三酮正丁醇溶液
五、實驗步驟[注1]
1. 薄層板的制備
取過160目篩孔的微晶纖維素粉3g 放于玻璃研缽中，仔細研磨，加入15mL蒸餾水，繼續研磨成漿糊狀后，倒在一塊5×20cm 的干凈干燥的玻璃板上。用玻棒推動纖維素粉狀物使其涂滿整個玻璃板，然后輕輕振動玻璃板，促使平整均勻。放置于水平實驗臺上讓其自然晾干，再放入烘箱中于 80℃烘烤半小時取出放在干燥器內待用。
2. 點樣
分別用毛細管在薄層板上離底邊一端1.5cm處點上標準溶液和樣品溶液，點與點之間的距離為1～1.5cm，并且各點要在一條線上。點樣時應分次點下，樣點直徑一般以2～4mm為宜。同一薄層上樣點的直徑應該一致。
3. 展開
首先在層析缸周圍襯墊濾紙，在層析缸內加入展開劑使液面高度為0.5～1cm。等展開劑飽和后（約5～10min），將點好樣品的薄層板下端浸入展開劑中，但不能使樣點浸入展開劑中。展開劑上升到10～15cm高時，取出層析板，標明溶劑前沿，用電吹風冷風將展開劑完全除去。
4. 顯色
將除去展開劑的層析板均勻噴上茚三酮顯色劑，然后置于80℃下烘干20～30min，即出現紫色斑點，取出后分別計算Rf值，并比較Rf值，判斷未知試樣中存在的物質。
六、思考問答
1．薄層層析分離物質的原理是什么?
2．用Rf值為什么能鑒定未知物?
3．薄層層析包括哪些操作步驟?
[注1]：圓珠筆油的分離操作方法同上。因圓珠筆油為有色物質，無需顯色，其展開劑為正丁醇∶乙醇∶水=3∶1∶1。