蚜蟲內共生菌菌胞的提取方法

實驗概要

Percoll溶液不連續密度梯度離心法提取蚜蟲的內共生菌菌胞。

實驗原理

Percoll是一種包有乙烯吡咯烷酮的硅膠顆粒。滲透壓很低(<20mosm／kg H_２O)，粘度也很小，可形成高達1.3g／mL密度，采用預先形成的密度梯度時可在低離心力(200～1000g)于數分至數十分鐘內達到滿意的細胞分離結果。由于Percoll擴散常數低，所形成的梯度十分穩定。此外，Percoll不穿透生物膜，對細胞無毒害，因此廣泛用于分離細胞、亞細胞成分、細菌及病毒，還可將受損細胞及其碎片與完好的活細胞分離。

主要試劑

1. 小牛血清

2. Percoll細胞分離液

3. 70%酒精

4. 0.85％NaCl

主要設備

1. 高速冷凍離心機(3K-30)

2. 4℃、-20℃冰箱

3. 奧林巴斯顯微鏡

4. 微量電動組織勻漿器

5. 長針頭注射器

6. 40 μL孔徑濾網

7. 1.5mL和10mL離心管

實驗材料

蚜蟲

實驗步驟

1. 不同濃度Percoll溶液的制備：先用9份Percoll原液與1份8.5％NaCl混合達到生理性滲透壓，獲得Percoll母液，然后用生理溶液0.85％NaCl稀釋到所需濃度。

2. 不連續密度梯度Percoll層的制備：先將試管壁用牛血清濕潤，除去多余血清，這種預處理可使逐層疊加的Percoll液平穩沿管壁流下，使形成滿意的界面。在制備過程中一般用長針頭注射器從高密度向低密度逐層放置，有時相鄰兩層Percoll比重相差不大時，可將Percoll液放入注射器中，小針頭斜面緊貼管壁，任其自然慢慢流下。

3. 制備樣品：蚜蟲成蟲采自溫室。將吸取的蟲體暫時浸于70%的酒精中，用滅菌雙蒸水反復漂洗數次，分批置于1.5 mL離心管中，用微量電動組織勻漿器研磨成粗樣，40 μL孔徑濾網過濾，濾液用0.85％NaCl稀釋成樣品，然后置于Percoll液的上層。

4. 離心：分別采用不同的離心力，不同的離心時間，進行離心篩選。

5. 吸取菌胞樣品：用長針頭注射器逐層去除Percoll液，收集界面部位的細胞，獲含有Percoll液的細胞，用0.85％NaCl溶液洗滌2次，定量PCR及顯微鏡檢測。